飼料中有毒有害物質(zhì)的測定課件

1、4/4/2024 1:44 AM,1,飼料中有毒有害物質(zhì)的測定,黎觀紅江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,4/4/2024 1:44 AM,2,9 飼料中有毒有害物質(zhì)的測定P244,（一）飼料質(zhì)量營養(yǎng)質(zhì)量：飼料營養(yǎng)成分含量；技術(shù)質(zhì)量：飼料的物理特性、如顆粒大小、形狀、硬度、適口性等、混合均勻度；衛(wèi)生（安全）質(zhì)量：對(duì)動(dòng)物、人和環(huán)境的安全；情緒質(zhì)量：倫理標(biāo)準(zhǔn)或感覺可影響對(duì)質(zhì)量的討論， 如有爭議的動(dòng)物性原料 或人造著色劑和調(diào)味劑。,一、概述,

2、,公眾對(duì)飼料質(zhì)量重要性的認(rèn)識(shí)的變化 表1,4/4/2024 1:44 AM,3,9 飼料中有毒有害物質(zhì)的測定,（二）幾起典型的飼料安全事故２０世紀(jì)８０年代中期至９０年代中期瘋牛病（“牛海綿狀腦病” ）的暴發(fā)流行。1999年1月15日以來，比利時(shí)、荷蘭、法國、德國相繼發(fā)生因動(dòng)物飼料被二惡英污染，導(dǎo)致畜禽類產(chǎn)品及乳制品含高濃度二惡英事件。 “瘦肉精”中毒問題、“毒奶粉（2008）”、“紅心鴨蛋（使用蘇丹紅，2006）”、“多寶魚

3、（藥物殘留，2006）”等。 “配合飼料有毒”、“配合飼料生產(chǎn)的肉蛋奶不能吃”、“小孩肥胖原因是吃了含激素的肉”。,一、概述,飼料安全等于畜產(chǎn)品安全！,4/4/2024 1:44 AM,4,都是藥殘惹的禍！,蘇丹紅,三聚氰胺,瘋牛病二惡英瘦肉精三聚氰胺蘇丹紅（紅心鴨蛋）孔雀石綠（水產(chǎn)品）抗生素等藥物殘留……,,,,,,,4/4/2024 1:44 AM,5,“飼料雞”,“土雞”,新概念雞蛋全是“扯蛋”？,4/4/202

4、4 1:44 AM,6,9 飼料中有毒有害物質(zhì)的測定,（三）飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)——強(qiáng)制性國家標(biāo)準(zhǔn) 對(duì)飼料中有獨(dú)有害物質(zhì)及有害微生物以法律形式做出的統(tǒng)一規(guī)定。 1991年版《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》：覆蓋面較小，造成許多事故糾紛無判定依據(jù)，一些重要的產(chǎn)品衛(wèi)生指標(biāo)沒有規(guī)定等。,一、概述,4/4/2024 1:44 AM,7,9 飼料中有毒有害物質(zhì)的測定,（三）飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)——強(qiáng)制性國家標(biāo)準(zhǔn) 2001年新版GB13078－2001《飼料衛(wèi)生

5、標(biāo)準(zhǔn)》： 有害物質(zhì)及微生物衛(wèi)生指標(biāo)項(xiàng)目增加了“鉻”在皮革、蛋白粉和雞、豬配合飼料中的允許量指標(biāo)。即由原標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的16項(xiàng)，修訂為17項(xiàng)。新版標(biāo)準(zhǔn)覆蓋的產(chǎn)品品種達(dá)66種，是原標(biāo)準(zhǔn)的3倍多。砷在磷酸鹽產(chǎn)品中的允許量指標(biāo)由每千克產(chǎn)品10毫克，修訂為20毫克。氟在磷酸氫鈣產(chǎn)品中的允許量指標(biāo)由每千克2000毫克，修訂為1800毫克。黃曲霉毒素B1指標(biāo)將肉用仔雞配合飼料分為前期料和后期料，其允許量分別為每千克飼料中10微克和20微克。補(bǔ)充

6、規(guī)定了與各項(xiàng)指標(biāo)相對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)方法，消除了原標(biāo)準(zhǔn)沒有指明特定試驗(yàn)方法的缺陷。,一、概述,4/4/2024 1:44 AM,8,9 飼料中有毒有害物質(zhì)的測定,（三）飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)——強(qiáng)制性國家標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)行的飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)將進(jìn)行不斷的修訂和完善！相對(duì)于發(fā)達(dá)國家的飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，我國的飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目偏少。新農(nóng)藥的不斷出現(xiàn)（現(xiàn)行飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)只規(guī)定了兩種農(nóng)藥的限量標(biāo)準(zhǔn)：六六六、滴滴涕）。敵敵畏 、敵百蟲 、甲胺磷 、菊酯類 、馬拉磷 、蚜螨磷安全

7、限量標(biāo)準(zhǔn)草案。 測定方法靈敏度的提高，對(duì)于某些有毒有害物質(zhì)限量的規(guī)定將可能發(fā)生改變。新飼料資源的開發(fā)利用。,一、概述,4/4/2024 1:44 AM,9,9 飼料中有毒有害物質(zhì)的測定,（四）飼料中有毒有害物質(zhì)的分類1. 按來源分： 天然：棉酚、硫甙、脲酶、胰蛋白酶抑制劑等 次生：微生物次生代謝產(chǎn)物，如黃曲霉毒素B1、由氨基酸產(chǎn)生的組胺、尸胺、腐胺、精胺等 外源性：重

8、金屬污染，2 按性質(zhì)分： 有機(jī)：棉籽餅粕、菜籽餅粕、蓖麻餅粕中的蓖麻毒素和蓖麻堿、四 季豆中的皂甙（皂素）和胰蛋白酶抑制劑等，病原微生物、霉菌毒素、有機(jī)農(nóng)藥等。 無機(jī)：鉛、砷、鉻、鎘、汞、氟、鉬等。,一、概述,,,4/4/2024 1:44 AM,10,9 飼料中有毒有害物質(zhì)的測定,砷的毒性：砷與動(dòng)物體組織中酶的巰基結(jié)合使之失活，損害機(jī)體全身組織。砷的氧化物毒性很高，三價(jià)砷毒性>五價(jià)；無機(jī)砷毒性

9、>有機(jī)砷：砒霜（As2O3 ）。一般情況下，植物性飼料砷含量很低。植物飼料中砷含量與土壤中的水平、農(nóng)藥污染和工業(yè)污染有關(guān)。,二、飼料中總砷的測定（P248）,4/4/2024 1:44 AM,11,,9 飼料中有毒有害物質(zhì)的測定,二、飼料中總砷的測定,有機(jī)砷飼料添加劑：對(duì)氨基苯砷酸（阿散酸）、對(duì)氨基苯砷酸鈉和3-硝基-4-羥基苯砷酸 （洛克殺生 ）。 促生長，抗球蟲及著色（使皮膚紅潤，毛色發(fā)亮）等功效。

10、我國制定的飼料中砷測定標(biāo)準(zhǔn)方法是測定飼料中總砷含量（目前的檢測方法還不能區(qū)分有機(jī)砷和無機(jī)砷），而衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中砷的限量標(biāo)準(zhǔn)為無機(jī)砷，造成了使用有機(jī)砷添加劑的配合料，含砷量超過我國國家允許量標(biāo)準(zhǔn)，這也使得檢測結(jié)果無法依據(jù)產(chǎn)品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行質(zhì)量判定。,4/4/2024 1:44 AM,12,9 飼料中有毒有害物質(zhì)的測定,二、飼料中總砷的測定,4/4/2024 1:44 AM,13,9 飼料中有毒有害物質(zhì)的測定,（一）概述黃曲霉毒素（aflat

11、oxins, AF）是由一組真菌（黃曲霉、曲霉等）產(chǎn)生的一組化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的真菌毒素。主要污染花生、玉米、棉籽及其餅粕等。對(duì)人和動(dòng)物均具有極強(qiáng)的毒性和致癌性。黃曲霉毒素還可在動(dòng)物產(chǎn)品中蓄積，影響人體健康。目前已分離鑒定出12種，包括B1、B2、G1、G2、M1、M2、P1、Q、H1、GM、B2a和毒醇。其中黃曲霉毒B1最為多見，其毒性和致癌性也最強(qiáng)。在自然條件下，飼料污染的黃曲霉毒素主要為AFB1、B2 、G1 、G2，其中以AF

12、B1含量最高。黃曲霉毒素的毒性、致癌性和蓄積性——飼料產(chǎn)品質(zhì)量控制中的必檢項(xiàng)目。,二、飼料中黃曲霉毒素B1的測定,4/4/2024 1:44 AM,14,9 飼料中有毒有害物質(zhì)的測定,(二)檢測方法酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）薄層層析法（thin layer chromatography，TLC）快速篩選法,,二、飼料中黃曲霉毒素B1的測定（P288）,

13、4/4/2024 1:44 AM,15,9 飼料中有毒有害物質(zhì)的測定,酶聯(lián)免疫吸附法1、原理 ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。以待測抗原（或抗體）與酶標(biāo)抗體（或抗原）的特異結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過酶活力測定來確定抗原（或抗體）含量。 特點(diǎn)：很強(qiáng)的特異性：建立在抗原與抗體免疫學(xué)反應(yīng)的基礎(chǔ)上。 很高的靈敏度：酶催化反應(yīng)。對(duì)于黃曲霉毒素B1，ELISA法最低可檢出0.1μg。,二、

14、飼料中黃曲霉毒素B1的測定,4/4/2024 1:44 AM,16,9 飼料中有毒有害物質(zhì)的測定,酶聯(lián)免疫吸附法 ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有3種必要的試劑：固相的抗原或抗體，酶標(biāo)記的抗原或抗體，酶作用的底物。,二、飼料中黃曲霉毒素B1的測定,4/4/2024 1:44 AM,17,酶聯(lián)免疫吸附法A、抗體將某種抗原經(jīng)各種途徑免疫動(dòng)物，成熟的B細(xì)胞克隆受到抗原刺激后，將抗體分泌到血

15、清和體液中。實(shí)際上血清中的抗體是多種單克隆抗體的混合物，因此稱之為多克隆抗體。,9 飼料中有毒有害物質(zhì)的測定,4/4/2024 1:44 AM,18,單克隆抗體是由生長在細(xì)胞培養(yǎng)物中的同一B細(xì)胞的群體（一個(gè)克隆）合成并分泌的、均一的、識(shí)別同一抗原表位的抗體。,4/4/2024 1:44 AM,19,酶聯(lián)免疫吸附法B、酶與底物：在ELISA中，常用的酶為辣根過氧化物酶(horseradish  peroxidase,

16、60; HRP)和堿性磷酸酶(alkaline  phosohatase,  AP)。在少數(shù)商品ELISA試劑中，應(yīng)用的酶尚有葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。辣根過氧化物酶底物：鄰苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)和ABTS。用2mol/L硫酸終止酶反應(yīng)。堿性磷酸酶底物：一般采用

17、對(duì)硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl  phosphate, p-NPP)作為底物，用NaOH終止酶反應(yīng)。,9 飼料中有毒有害物質(zhì)的測定,4/4/2024 1:44 AM,20,酶聯(lián)免疫吸附法B、酶與底物：在ELISA中，常用的酶為辣根過氧化物酶(horseradish  peroxidase,  HRP)和堿性磷酸酶(alkaline  phosohatase,  AP)。

18、在少數(shù)商品ELISA試劑中，應(yīng)用的酶尚有葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。辣根過氧化物酶底物：鄰苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)和ABTS。用2mol/L硫酸終止酶反應(yīng)。堿性磷酸酶底物：一般采用對(duì)硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl  phosphate, p-NPP)作為底物，用Na

19、OH終止酶反應(yīng)。,9 飼料中有毒有害物質(zhì)的測定,4/4/2024 1:44 AM,21,酶聯(lián)免疫吸附法ELISA最常用的四種方法：直接法測定抗原；間接法測定抗體；雙抗體夾心法測定抗原；競爭法測定抗原。,9 飼料中有毒有害物質(zhì)的測定,4/4/2024 1:44 AM,22,（1）  直接法測定抗原 A.      將抗原吸附在載體表面； B. 

20、;     加酶標(biāo)抗體，形成抗原—抗體復(fù)合物； C. 加底物。底物的降解量＝抗原量。,4/4/2024 1:44 AM,23,（2）間接法測定抗體A.      將抗原吸附于固相載體表面；B.      加抗體, 形成抗原-抗體復(fù)合物; C.   &

21、#160;  加酶標(biāo)抗體；D. 加底物。 測定底物的降解量＝抗體量。,4/4/2024 1:44 AM,24,（3）雙抗體夾心法測定抗原A.      將抗體吸附于固相表面; B.      加抗原，形成抗原-抗體復(fù)合物; C.     加酶標(biāo)抗體; E. 加底

22、物。底物的降解量＝抗原量。,4/4/2024 1:44 AM,25,（4）競爭法測定抗原A.  將抗體吸附在固相載體表面; B. 加入酶標(biāo)抗原和待測抗原，競爭結(jié)合抗體； 對(duì)照只加入酶標(biāo)抗原； C. 加底物。對(duì)照孔與樣品孔底物降解量的差＝未知抗原量。,4/4/2024 1:44 AM,26,黃曲霉毒素B1酶聯(lián)免疫競爭檢測法,,,4/4/2024 1:44 AM,27,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

23、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,樣品,,黃曲霉毒素B1分子,4/4/2024 1:44 AM,28,微 孔 表 面 情 況,,,,,AFB1抗體,4/4/2024 1:44 AM,29,標(biāo)準(zhǔn)品,4/4/2024 1:44 AM,30,,,標(biāo)準(zhǔn)溶液,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

24、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,4/4/2024 1:44 AM,31,酶標(biāo)抗原,,,,,,,,,,,,4/4/2024 1:44 AM,32,酶標(biāo)抗原,酶,AFB1,4/4/2024 1:44 AM,33,標(biāo)準(zhǔn)品, 樣品 和 酶標(biāo)抗原加進(jìn)微孔,4/4/2024 1:44 AM,34,,,,樣品

25、,酶標(biāo)抗原,樣 品 孔,先加,后加,4/4/2024 1:44 AM,35,,,,標(biāo)準(zhǔn)品,酶標(biāo)抗原,標(biāo) 準(zhǔn) 孔,先加,后加,4/4/2024 1:44 AM,36,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

26、孵育30分鐘,抗 原 與 抗 體 結(jié) 合,4/4/2024 1:44 AM,37,微 孔 清 洗,4/4/2024 1:44 AM,38,洗滌5次，間隔2分鐘,,,,,,,,,,,,,,,4/4/2024 1:44 AM,39,加入酶催化反應(yīng)底物,4/4/2024 1:44 AM,40,,,,,,,,,,,,加入反應(yīng)底物A和B,,,孵 育 15 分 鐘,4/4/2024 1:44 AM,41,,,,,,,,,,,,顯

27、 色,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,4/4/2024 1:44 AM,42,,,,,,,,,,,,4/4/2024 1:44 AM,43,反 應(yīng) 孔,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,4/4/2024 1:44 AM,44,陰 性 對(duì) 照 孔,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

28、,,,,,,,,,,,4/4/2024 1:44 AM,45,,陰性對(duì)照孔=沒有黃曲霉毒素B1分子與酶標(biāo)抗原競爭所有抗體都與酶標(biāo)抗原結(jié)合,4/4/2024 1:44 AM,46,陽 性 對(duì) 照 孔,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,4/4/2024 1:44 AM,47,,1 ng/ml 標(biāo)準(zhǔn)孔 = 黃曲霉毒素B1分子結(jié)合到抗體上剩余的抗體再與酶標(biāo)抗原結(jié)合,4/4/2024 1:44

29、AM,48,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,陽 性 樣 品,,,,,,,,,,,酶標(biāo)抗原結(jié)合得越少，顏色越淺,,4/4/2024 1:44 AM,49,,加入終止液，反應(yīng)液由藍(lán)色變成黃色，上酶標(biāo)儀讀取數(shù)據(jù)，畫標(biāo)準(zhǔn)曲線,4/4/2024 1:44 AM,50,,,,,,,,調(diào)零孔,陰性孔,0.1 ng/ml,0.5 ng/ml,1 ng/ml,5 ng/ml,10 ng/m

30、l,酶聯(lián)免疫競爭法標(biāo)準(zhǔn)曲線,,,,,,0.1,1,10,ng/ml,,,,,,,O.D.,,,4/4/2024 1:44 AM,51,不同溫度條件下的標(biāo)準(zhǔn)曲線,,,,,,0.1,1,10,ng/ml,,,,,,,O.D.,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,調(diào)零孔,陰性孔,0.1 ng/ml,0.5 ng/ml,1 ng/ml,5 ng/ml 10 ng/ml,4/4/2024 1:44 AM,52,以