人紅細胞膜上protein4.2與其它蛋白質的相互作用研究

1、’≯．1 0 2 2 5 3 9檻旦大學博士學位論文學校代碼：學 號：人紅細胞膜上P r o t e i n4 ．2 與其它蛋白質的相互作用研究院 系( 所) ： 生命科學學院專姓業(yè)： 生物物理學名： 蘇腸指導教師： 張恣鴻教授完成日期： 2 0 0 6 年4 月1 0 2 4 60 3 1 0 2 3 0 7 5復旦大學博士學位論文( 1 0 0 ．2 1 1 ) 、G S T - P 4 ．2 ( 1 0 0 - 2 6 0 ) 和

2、T r x - P 4 ．2 ( 1 ．3 0 0 ) 。我們還克隆表達了G S T - c d b 3 、H i s 6 - c d b 3 、G S T - a n k y r i n D 3 4 和T r x - a n k y r i n D 3 4 這四種重組蛋白。經(jīng)過優(yōu)化表達條件，并通過離子交換層析、親和層析和分子篩純化，我們得到了較純的各種重組蛋白。通過S D S ．P A G E 和W e s t e r n b l o

3、 t ，驗證了各種重組蛋白。隨后通過F a r - W e s t e r n b l o t 和P u l l - d o w na s s a y 實驗，我們發(fā)現(xiàn)P 4 ．2 的第3 1 - 2 0 0位氨基酸片段是與a n k y r i n 可能的直接相互作用區(qū)段，而且很可能是在第1 8 7 ．2 0 0位氨基酸區(qū)段；P 4 ．2 與c d b 3 的相互作用區(qū)段精確到第2 0 1 ．2 1 1 位氨基酸。由于目前為止共有9 種

4、P 4 ．2 基因突變可以導致遺傳性球形紅細胞增多癥，其中4 種錯義突交特別引起了我們的注意。通過對比P 4 ．2 的三維結構模擬圖，發(fā)現(xiàn)發(fā)生突變的第1 7 5 位氨基酸殘基恰好位于連接P 4 ．2 的兩個結構域d o m a i n l和d o m a i n 2 的區(qū)段上，所以我們預測第1 7 5 位氨基酸殘基的突變可能導致P 4 ．2不能與a n k y r i n 結合。于是我們采用了點突變的方法，克隆表達了4 種重組的突變蛋白

5、G S T o P 4 ．2 ( 3 1 ．2 0 0 ) D 1 7 5 Y 、G S T - P 4 ．2 ( 3 1 ．2 0 0 ) D 1 7 5 Y 、G S T - P 4 ．2 ( 1 0 0 ．2 6 0 )D 1 7 5 Y ，G S T - P 4 ．2 ( 3 1 - 2 0 0 ) A 1 4 2 T ，發(fā)現(xiàn)第1 7 5 位氨基酸殘基的突變使得相應的重組蛋白均不能與a n k y r i n 直接相互作用，而第

6、1 4 2 位氨基酸殘基的突變對P 4 ．2與a n k y r i n 之間的相互作用沒有影響，這說明第1 7 5 位氨基酸對于P 4 ．2 與a n k y r i n的結合是非常重要的，很可能是一個關鍵位點。為了進一步研究第1 7 5 氨基酸殘基突變對相互作用產(chǎn)生影響的模式，我們根據(jù)第1 7 5 位氨基酸由D ( A s p ) 突變?yōu)閅 ( T y r ) ，設計了相應的3 種氨基酸殘基突變，分別是D ( A s p ) 突變?yōu)?/p>

7、K ( L y s ) 、F ( P h e ) 和A ( A l a ) 。通過F a r - W e s t e r n b l o t和P u l l - d o w n a s s a y ，我們發(fā)現(xiàn)G S T - P 4 ．2 ( 3 1 - 2 0 ∞D 1 7 5 K 能夠與a n k y r i n 直接相互作用，而其它兩種突變蛋白G S T - P 4 ．2 ( 3 1 - 2 0 0 ) D 1 7 5 F 和G S

8、 T - P 4 ．2 ( 3 1 - 2 0 0 ) D 1 7 5 A均不能與a n k y f i n 直接結合。因此，我們認為，在P r o t e i n 4 ．2 K o m a t s u 中，第1 7 5 位氨基酸殘基由帶負電荷的天冬氨酸突變?yōu)榉菢O性的帶芳香環(huán)的酪氨酸，由于電荷效應的改變引起了P 4 ．2 蛋白的d o m a i n l 和d o m a i n 2 之間的空問結構發(fā)生變化，導致了P 4 。2 與a n