豬嗜血支原體MSG1蛋白與豬紅細胞膜蛋白相互作用的研究.pdf

1、豬嗜血支原體（Mycoplasmasuis,M.suis）是豬附紅細胞體病(PorcineEperythrozoonosis，PE)的病原體，該病原是一類無細胞壁、嗜血液寄生的多形態(tài)微生物，臨床上可以引起豬的熱性、溶血性、散發(fā)性傳染病，并以高熱、貧血、黃疸等為主要特征，一般呈不顯性感染，多在應(yīng)激因素作用下發(fā)病。豬嗜血支原體病在全球分布廣泛，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴重的經(jīng)濟損失。目前，M.suis還不能在體外培養(yǎng)，而且對該病原感染紅細胞的致病機制

2、還不清楚。MSG1蛋白是豬嗜血支原體的一種重要的表面黏附蛋白，M.suis通過其表面黏附蛋白和紅細胞的吸附是發(fā)揮致病作用的第一步，因此，探索與MSG1蛋白相互作用的紅細胞膜蛋白具有非常重要的意義。本研究具體內(nèi)容如下:
　　1.豬嗜血支原體表面黏附蛋白MSG1相關(guān)紅細胞膜蛋白的篩選與鑒定
　　首先提取健康豬紅細胞膜蛋白，然后應(yīng)用原核表達的M.suis重組MSG1蛋白(His-tag)采用親和層析方法，將重組MSG1蛋白和豬紅細

3、胞膜蛋白依次結(jié)合到Ni-NTA親和層析柱上，通過洗滌雜蛋白后，最后洗脫與重組MSG1蛋白結(jié)合的紅細胞膜蛋白。SDS-PAGE電泳后對捕獲的三條蛋白條帶切膠進行質(zhì)譜分析，質(zhì)譜分析結(jié)果顯示這三種紅細胞膜蛋白分別是豬乳轉(zhuǎn)鐵蛋白（Lactotransfferrin，LTF），肌動蛋白(β-actin)和帶3蛋白(Band3)。
　　2.紅細胞膜蛋白多克隆抗體的制備及鑒定
　　通過基因合成方法合成了LTF全基因(2115bp)，以此合

4、成基因為模板擴增出LTF全基因N端762bp堿基(LTF-N762)。將PCR擴增出的基因片段連接到pET-32a(+)原核表達載體中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-32a-LTF-N762。用IPTG誘導(dǎo)進行蛋白表達，SDS-PAGE結(jié)果顯示兩個重組表達菌株均表達了高水平的重組蛋白32a-LTF-N762。以原核表達純化的重組蛋白采用背部多點皮下注射方法分別免疫小鼠和家兔，間隔兩周免疫一次，第三次免疫后通過間接ELASA方法測定抗血清效價，3

5、2a-LTF-N762蛋白小鼠和家兔的抗血清效價分別為1∶102400、1∶51200。Westernblot結(jié)果證明這兩種抗血清均能與重組蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)。
　　用KLH偶聯(lián)的小肽（band3:CGPEDPHIDYNQLGR）制備band3兔多克隆抗體，免疫和檢測方法同上，間接ELASA結(jié)果顯示抗體效價達到1∶512000;β-actin抗體來自商品化兔多抗。用LTF、Band3和β-actin三種兔多抗分別鑒定健康豬紅細胞膜

6、蛋白，Westernblot實驗結(jié)果顯示這三種抗體均能與紅細胞膜蛋白發(fā)生特異性反應(yīng);間接免疫熒光實驗(IFA)結(jié)果顯示紅細胞邊緣均出現(xiàn)特異性綠色熒光，證明了本研究通過親和層析法篩選的紅細胞膜蛋白均存在紅細胞膜上。
　　3.豬嗜血支原體MSG1蛋白與紅細胞膜蛋白相互作用的分析
　　用純化的豬嗜血支原體重組MSG1蛋白和已制備的MSG1單克隆抗體(1A7)在紅細胞和哺乳動物細胞上分別進行間接免疫熒光實驗，結(jié)果證明重組MSG1蛋白

7、能夠與紅細胞和哺乳動物細胞發(fā)生特異性吸附。激光共聚焦實驗結(jié)果證明MSG1蛋白能分別與LTF、Band3和β-actin三種蛋白共定位在紅細胞膜上。此外，本研究設(shè)計并合成β-actinsiRNA片段，在哺乳動物細胞水平進行siRNA干擾，實驗結(jié)果證明了MSG1蛋白與β-actin的特異性相互作用。
　　綜上所述，本研究篩選了與豬嗜血支原體表面黏附蛋白MSG1相關(guān)的三種豬紅細胞膜蛋白，并制備了LTF和Band3蛋白兔多克隆抗體，進一步