人胎肝細(xì)胞質(zhì)膜和人紅細(xì)胞膜蛋白質(zhì)組分析.pdf

1、細(xì)胞質(zhì)膜構(gòu)成細(xì)胞對(duì)外界環(huán)境的屏障和細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境交流的界面，鑲嵌或連接于其中的蛋白質(zhì)對(duì)維持細(xì)胞正常的生理活動(dòng)具有十分重要的作用，這些蛋白質(zhì)參與細(xì)胞—細(xì)胞或細(xì)胞—細(xì)胞外基質(zhì)的識(shí)別、粘附、連接和通訊，信號(hào)的接受和跨膜傳導(dǎo)，細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)等，影響著細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、病變等。細(xì)胞質(zhì)膜蛋白占到已知藥物靶標(biāo)的70％，因此，細(xì)胞質(zhì)膜已經(jīng)成為廣泛的藥物設(shè)計(jì)的靶標(biāo)，細(xì)胞質(zhì)膜蛋白質(zhì)組得到學(xué)術(shù)界的高度重視。 16-24周孕齡人胎肝處于關(guān)鍵的

2、造血調(diào)控和發(fā)育分化時(shí)期，分析人胎肝細(xì)胞質(zhì)膜蛋白質(zhì)組有助于對(duì)人胎肝的這些生理活動(dòng)的認(rèn)識(shí)。我們用差速離心和密度梯度離心提取純化了人胎肝細(xì)胞質(zhì)膜，細(xì)胞質(zhì)膜標(biāo)志酶-5’單核苷酸酶特異酶活測(cè)定顯示其富集度達(dá)到16倍。用SDS-PAGE-RPLC-ESI-MS/MS和“shotgun”(蛋白三重裂解-SCX-RPLC-ESI-Q-TOF-MS)兩條技術(shù)路線，我們從人胎肝細(xì)胞膜和堿處理細(xì)胞膜中鑒定了總共532個(gè)非冗余蛋白質(zhì)，另有82個(gè)蛋白group。

3、這是目前已知最大的人類組織細(xì)胞質(zhì)膜表達(dá)譜。在人胎肝細(xì)胞質(zhì)膜蛋白質(zhì)表達(dá)譜中，已知明確定位于細(xì)胞質(zhì)膜上的蛋白質(zhì)126個(gè)，占鑒定蛋白總數(shù)的24.5％?？缒さ鞍?62個(gè)，占30.5％，未知蛋白41個(gè)。126個(gè)細(xì)胞質(zhì)膜蛋白基本覆蓋了細(xì)胞質(zhì)膜上所有的功能模塊，其中轉(zhuǎn)運(yùn)體、膜骨架、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、受體、細(xì)胞連接、細(xì)胞粘附和代謝酶類蛋白所占比例最高，分別為18、15、14、11、10、9和6％。這與人胎肝細(xì)胞質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)和生理功能密切相關(guān)。另外，在人胎肝細(xì)胞質(zhì)

4、膜上鑒定了一些已報(bào)道在細(xì)胞質(zhì)膜上有定位但常見(jiàn)于其它亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的蛋白，如細(xì)胞質(zhì)蛋白HSP27和HSP70；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白GRP和PDI；線粒體蛋白VDAC-1、HSP60和ATP合成酶；細(xì)胞核蛋白Lasp-1，hRNP和組蛋白。這些蛋白質(zhì)可能參與新的細(xì)胞質(zhì)膜上的生理活動(dòng)。 鑒于在提取人胎肝細(xì)胞質(zhì)膜時(shí)不可避免地存在其它內(nèi)膜系統(tǒng)的污染，對(duì)于鑒定的非已知細(xì)胞質(zhì)膜蛋白，我們不能確定是發(fā)生真正的定位變化而存在于細(xì)胞質(zhì)膜還是其它亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的污染

5、。正常人紅細(xì)胞只由胞漿和細(xì)胞膜構(gòu)成，因而紅細(xì)胞膜不會(huì)有其它亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的污染。所以我們選用正常人紅細(xì)胞膜作為模式細(xì)胞膜進(jìn)一步對(duì)其蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析。通過(guò)與研究人胎肝細(xì)胞質(zhì)膜相同的兩條技術(shù)策略從正常人紅細(xì)胞膜上鑒定了112個(gè)非冗余蛋白質(zhì)。其中整合膜蛋白64個(gè)，占總蛋白的55％，功能未知蛋白16個(gè)。這些蛋白質(zhì)主要集中于膜骨架、轉(zhuǎn)運(yùn)體、膜運(yùn)輸、血型系統(tǒng)(細(xì)胞粘附)和代謝酶幾種功能類別。糖基化修飾蛋白占鑒定蛋白的24％，且88.5％是整合膜蛋白。讓

6、人感到意外的是在鑒定的112個(gè)蛋白質(zhì)中，ras超家族蛋白占10％，包括2個(gè)rap蛋白，9個(gè)rab蛋白，它們可能參與紅細(xì)胞膜的特殊生理活動(dòng)。此外，在紅細(xì)胞膜上鑒定到一些其它亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，包括參與氧化還原、脂類代謝、糖酵解、蛋白運(yùn)輸和蛋白降解等生理功能蛋白和組蛋白。由于紅細(xì)胞膜不會(huì)有其它亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的污染，我們認(rèn)為這些蛋白質(zhì)在紅細(xì)胞膜上定位的可能性非常大。此點(diǎn)得到來(lái)自人胎肝細(xì)胞質(zhì)膜蛋白質(zhì)組研究的部分支持，提示這些蛋白的細(xì)胞質(zhì)膜定位可能具

7、有普遍意義。另外，在蛋白類別上紅細(xì)胞膜和人胎肝具有相似之處，即兩者的轉(zhuǎn)運(yùn)體、膜骨架和代謝酶蛋白比例比較高，但也有特殊之處，人胎肝細(xì)胞質(zhì)膜上的受體與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)類分子和細(xì)胞連接類蛋白更多，這可能與人胎肝處于旺盛的造血和發(fā)育分化時(shí)期有關(guān)；紅細(xì)胞膜上則血型蛋白和膜運(yùn)輸?shù)鞍姿急壤容^高。 為進(jìn)一步了解人紅細(xì)胞膜上這些蛋白質(zhì)之間的聯(lián)系，全景式地發(fā)掘紅細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)復(fù)合體，我們采用藍(lán)色非變性膠(blue-nativegel)、SDS-PA

8、GE、反相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜分析紅細(xì)胞膜上的復(fù)合體，分離到3條可見(jiàn)帶，分子量高的兩條帶主要是由膜骨架和帶3蛋白構(gòu)成的已知復(fù)合體，從稍低分子量帶鑒定的蛋白質(zhì)主要包括血型蛋白、3種關(guān)鍵糖酵解酶(3-磷酸甘油醛脫氫酶、醛縮酶A和醛縮酶C)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體1、CD47、stomatin、帶3蛋白和個(gè)別骨架蛋白。并用western-blot從BN膠上第3條帶中檢測(cè)出3-磷酸甘油醛脫氫酶和磷酸果糖激酶。據(jù)此我們推測(cè)：1)糖酵解酶以復(fù)合體形式存在于紅細(xì)胞質(zhì)

9、膜上，它能進(jìn)一步和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體形成更大的復(fù)合體；2)紅細(xì)胞膜上已知的幾大復(fù)合體并非獨(dú)立存在，而是相互聯(lián)系，可能構(gòu)成更大的代謝相關(guān)的超復(fù)合體。此推測(cè)具有重要的學(xué)術(shù)意義，但尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。 總之，利用SDS-PAGE和“shotgun'”策略分析人胎肝細(xì)胞質(zhì)膜和人紅細(xì)胞膜的蛋白質(zhì)組，發(fā)現(xiàn)兩者的蛋白質(zhì)分布既具有細(xì)胞膜共有的特性，也具有與各自的生理活動(dòng)相對(duì)應(yīng)的特點(diǎn)。揭示了一些其它亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白可能具有細(xì)胞質(zhì)膜定位的普遍現(xiàn)象。利用