南極嗜冷菌colwelliasp.nj341產(chǎn)適冷蛋白酶及低溫適應(yīng)性的研究

1、 南極嗜冷菌C o l w e l l i a s pN J 3 4 1 產(chǎn)適冷蛋白酶及低溫適應(yīng)性的研究m l ／2 5 0 m l 搖瓶；6 ％N a C I 鹽度對(duì)菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶最有利：酪蛋白和檸檬酸鈉分別為培養(yǎng)基中最佳氮源和碳源；K + 和吐溫．8 0 有利于產(chǎn)酶；氨基酸對(duì)產(chǎn)酶的影響較小。在單因素基礎(chǔ)上，首次將響應(yīng)面分析法( R S M ) 應(yīng)用到低溫發(fā)酵培養(yǎng)中，模擬出產(chǎn)蛋白酶的二次多元回歸模型，確定了最優(yōu)的發(fā)酵條件為：酪蛋白

2、，5 ∥1 ；檸檬酸鈉，3 ．7 5 胡；吐溫一8 0 ，O ．2g ／1 ；酵母提取物，l g ／l ；N a C l ，1 0g ／l ；陳海水，10 0 0 m l ；初始p H ，7 ．5 ；溫度，8 ℃；2 0 0r p m 振蕩培養(yǎng)9 6 h 。通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)蛋白酶模型有較好擬合性，產(chǎn)酶量達(dá)到1 7 5U ／m l ，產(chǎn)酶穩(wěn)定性好。這些數(shù)據(jù)將為該酶的大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)提供重要參數(shù)。( 3 ) 通過(guò)硫酸銨沉淀、D E A E

3、 ．S e p h a d e xA 5 0 離子交換層析、S e p h a d e xG ．7 5凝膠過(guò)濾和D E A E ．S e p h a r o s eF a s tF l o w 陰離子交換層析四個(gè)主要分離步驟后，嗜冷菌C o l w e l l i as p ．N J 3 4 1 適冷蛋白酶純化物總蛋白為0 ．4m g ；酶的總純化倍數(shù)達(dá)3 1 ．3 倍；總回收率為8 ．9 ％；比活力提高至t J l 38 2 6 ．0

4、 U ／r a g ；考馬斯亮蘭染色、銀染和酶譜電泳鑒定均為單一帶，表明該蛋白酶達(dá)到了均一性。進(jìn)一步通過(guò)H P L C 對(duì)純化后蛋白酶樣品純度進(jìn)行鑒定，呈單一主峰，純度為9 1 ．8 ％，達(dá)到色譜純純度。利用M A L D I ．T O F ．M S 質(zhì)譜測(cè)定其分子量為5 9 ．8 1 6 k D a 。( 4 ) 在獲得較高酶純度的基礎(chǔ)上，首次對(duì)南極嗜冷菌C o l w e l l i a s p ．N J 3 4 1 所產(chǎn)胞外適冷絲

5、氨酸酶酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)的研究。結(jié)果表明，該菌株主要分泌一種胞外適冷蛋白酶，其最適溫度為3 5 ℃；它對(duì)高溫具有不穩(wěn)定性，5 0 ℃處理3 0 r a i n 或6 0 ℃處理1 0r n l ’n “l(fā) 扼徹底滅活；- 7 8 ℃和一2 0 ℃保藏是最佳的保藏方法。在p H 5 - 1 2時(shí)蛋白酶都有活力，p H 9 時(shí)酶活力最高；在最J 舌_ p H 范圍之內(nèi)，酶是穩(wěn)定的。絲氨酸蛋白酶抑制劑( P S F M ) 對(duì)該酶抑制作用最強(qiáng)；

6、金屬蛋白酶抑制劑E D T A 和E G T A 、金屬離子和變性劑均有一定的抑制作用：而半胱氨酸蛋白酶抑制劑E 一6 4對(duì)蛋白酶活力沒有影響；表面活性劑對(duì)酶活力影響小。在不同溫度條件下，J ．( m變化幅度不大，在溫度為3 5 。C 達(dá)到最大值；隨著溫度升高，‰。和‰a t ／島一直增加，其最大值出現(xiàn)在4 0 。C ，分別是0 。C 時(shí)的2 ．9 和2 ．1 倍；蛋白酶的活化能為3 6 ．7 k J ／m o l 。4 。C 下該酶對(duì)