適冷蛋白酶與中溫蛋白酶溫度適應(yīng)的分子基礎(chǔ)及其在海洋生物蛋白資源高值化加工中的應(yīng)用研究

1、山東大學(xué)博士學(xué)位論文適冷蛋白酶與中溫蛋白酶溫度適應(yīng)的分子基礎(chǔ)及其在海洋生物蛋白資源高值化加工中的應(yīng)用研究姓名：何海倫申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：海洋生物學(xué)指導(dǎo)教師：張玉忠20050101山東大學(xué)博士學(xué)位論文摘 要第一部分、適冷蛋白酶和中溫蛋白酶溫度適應(yīng)的分子基礎(chǔ)自l9 9 9 年以來，實(shí)驗(yàn)室開展了對深海適冷微生物和適冷蛋自酶的研究工作。陳秀蘭等( 2 0 0 1 ) 從1 8 5 5 米深的海底淤泥中分離到產(chǎn)適冷蛋白酶的適冷菌P s e u

2、 d o a l t e r o m o n a s s p ．S M 9 9 1 3 ，分離純化了該菌分泌的具有典型適冷特征的適冷蛋白酶M C P - - 0 1 ，對并對其酶學(xué)特性進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，研究表明M C P ．0 1 為適冷絲氫酸蛋白酶( C h e n e ta 1 ．2 0 0 2 ，C h e ne ta l ，2 0 0 3 a ；C h e n e ta l ，2 0 0 3 b ) 。在此研究基礎(chǔ)上，以屬于同一

3、家族的中溫蛋白酶B P ．0 1 為參照，對M C P 一0 l 結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，揭示了M C P ．0 1 高效適冷催化、穩(wěn)定性差、對熱敏感的分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。首先克隆了B P —0 1 的基因，根據(jù)基因的堿基序列推導(dǎo)出B P ．0 1 的氨基酸序列，與潘軍( 2 0 0 5 ) 推導(dǎo)的M C P ．0 1 的氨基酸序列進(jìn)行比對，結(jié)果表明M C P ．0 l和B P ．0 1 的氨基酸序列同源性較低。通過同源模建，分別構(gòu)

4、建了M C P ．0 1 和B P ．0 l的三維結(jié)構(gòu)。M C P ．0 1 和B P —O l 的催化結(jié)構(gòu)域都屬于s u b t i l a s e ．s 8 類型，二者的活性中心的構(gòu)象相似，由a 螺旋和p 折疊組成了酶的催化腔，參與催化反應(yīng)的三個氨基酸錢基A s p ，S e r 和H i s 都位于催化腔內(nèi)，表明M C P ．0 1 和B P —O l 的催化機(jī)制相同。與B P —0 1 相比，M C P ．0 1 分子中a 螺旋

5、較少．而D 轉(zhuǎn)角和無軌卷曲較多，使得分子柔性增強(qiáng)，更易變構(gòu)．C D 光譜檢測也證實(shí)了這一點(diǎn)。M C P ．O i 和B P ．0 1的變構(gòu)溫度分別為4 9 ．5 ℃和6 0 ．2 ℃，表明M C P 一0 1 更易變構(gòu)。絲氨酸蛋白酶抑制劑P M S F 能夠完全抑制M C P ．0 1 和B P ．0 1 的活性，但C D光譜和熒光光譜表明，P M S F 對兩者的構(gòu)象沒有影響。由于M C P ．0 1 活性中心有c a ”存在，E D

6、 T A 對M C P 一0 1 構(gòu)象和活性影響較大，a 螺旋減少明顯減少，而對B P ．0 1 的活性和構(gòu)象沒有影響，推測M C P ．叭的柔性構(gòu)象需要C a 2 + 維持其穩(wěn)定。鹽酸胍通過爭奪蛋白質(zhì)分子中結(jié)合的水分子而引起蛋白構(gòu)象的改變。鹽酸胍使兩種蛋白酶的熒光發(fā)射峰降低，且發(fā)生紅移，M C P ．0 1 紅移較大，近2 0 h m ，說明M C P - 0 1 和B P ·0 1 分子中T y r 和T r p 的位置及