28788.thermolysin家族金屬蛋白酶的適冷機(jī)制及深海適冷菌pseudoalteromonassp.sm9913對(duì)有機(jī)氮的降解

1、山東大學(xué)博士學(xué)位論文Thermolysin家族金屬蛋白酶的適冷機(jī)制及深海適冷菌Pseudoalteromonassp.SM9913對(duì)有機(jī)氮的降解姓名：邊斐申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：微生物學(xué)指導(dǎo)教師：張玉忠20090527山東大學(xué)博士學(xué)位論文隆與表達(dá)及其生化和酶學(xué)性質(zhì)研究。(1)深海適冷菌旦spSM9913所產(chǎn)胞外金屬蛋白酶MCP02的研究。本論文通過(guò)使用巢式PCR和TAILPCR等技術(shù)手段，克隆了深海適冷菌PspSM9913所產(chǎn)胞外金屬蛋

2、白酶MCP02的全基因序列。mcp一02基因全長(zhǎng)2184bp，編碼含有727個(gè)氨基酸殘基的蛋白酶前體?；蛐蛄屑禾峤籊enBank，序列號(hào)為EF029091(核酸序列)，ABL06977(氨基酸序列)。序列分析表明，MCP02為Zn金屬蛋白酶，屬于Thermolysin家族，Vibriolysin亞家族(Vibriolysinsubfamily，M04003)。將MCP02在Ecoli中進(jìn)行異源表達(dá)，使用硫酸銨沉淀、陰離子交換層析等技術(shù)

3、，從胞外分離純化得到了電泳純的重組MCP02酶。N端測(cè)序表明重組酶和野生酶具有相同的N端序列，表明獲得的mcp一02基因序列是正確的。MAIDITOF質(zhì)譜分析表明，成熟的重組酶MCP一02分子量為33929Da。綜合酶分子量和N端序列，推斷MCP02成熟酶長(zhǎng)315氨基酸殘基(A205D519)。以酪蛋白為底物，MCP02最適催化pH為8O，最適催化溫度為570C。550C半衰期tl／2為90min，600C半衰期tl／2為23min。對(duì)

4、二肽合成底物的降解(pH80)表明，MCP02偏好降解P1’位是大的疏水殘基的二肽底物，順序?yàn)镻heLeuVal。對(duì)MCP02的研究是對(duì)深海來(lái)源的Thermolysin家族適冷酶生化和酶學(xué)性質(zhì)的首次研究。(2)北極海冰細(xì)菌衛(wèi)spSM495所產(chǎn)胞外金屬蛋白酶E495的研究。本論文通過(guò)使用巢式PCR和TAILPCR等技術(shù)手段，克隆了北極海冰細(xì)菌PspSM495所產(chǎn)胞外金屬蛋白酶E495的全基因序列。蛋白酶E495的基因全長(zhǎng)2193bp，編碼

5、含有730個(gè)氨基酸殘基的蛋白酶前體?；蛐蛄幸烟峤籊enBank，序列號(hào)為FJ211191(核酸序YU)，ACl28452(氨基酸序列)。序列分析表明，E495為Zn金屬蛋白酶，屬于Thermolysin家族的Vibriolysin亞家族。將E495在Ecoli中進(jìn)行異源表達(dá)，使用超聲波破碎、硫酸銨沉淀、陰離子交換層析、NativePAGE等技術(shù)，從周質(zhì)空間分離純化得到了電泳純的重組FA95酶。N端測(cè)序表明重組酶和野生酶具有相同的N端序