菲高效降解菌的馴化、分離、鑒定及其降解菲的特性與機(jī)理研究.pdf

1、多環(huán)芳烴(polycyclicaromatichydrocarbons，PAHs)是一類廣泛存在于環(huán)境中的有機(jī)污染物。大多數(shù)的多環(huán)芳烴具有“三致”作用，通過食物鏈的傳遞會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境和人體健康造成極大危害，因而這類化合物引起了環(huán)境學(xué)家們的關(guān)注。如何利用微生物的降解作用將其從環(huán)境中去除已成為人們研究的熱點(diǎn)問題。 本論文以菲為多環(huán)芳烴生物降解研究的模型物，主要研究?jī)?nèi)容包括：(1)多環(huán)芳烴菲降解菌的馴化、篩選和分離；(2)降解菌株GY

2、2B的鑒定、抗生素敏感性試驗(yàn)以及質(zhì)粒的提取試驗(yàn)；(3)菲的降解特性研究，以及溫度、pH、外加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和初始底物濃度等因素對(duì)菌株GY2B的生長(zhǎng)和菲降解的影響；(4)菲降解菌的底物降解范圍研究；和(5)菲生物降解中間產(chǎn)物的分析及其代謝途徑的推導(dǎo)。 選用水-硅油雙相體系和單一水相體系兩種方法來(lái)馴化多環(huán)芳烴降解菌。結(jié)果發(fā)現(xiàn)水-硅油雙相體系篩選出的三種混合菌系：GY2、GS3和GM2對(duì)菲的降解效果要好于單一水相體系篩選出的菌。進(jìn)一步研究

3、確認(rèn)這三種混合菌系在72h能分別降解99.9﹪、99.9﹪和91.9﹪的菲(初始濃度100mg/L)。通過平板涂布與劃線，從混合菌GY2中分離出一株菲高效降解菌GY2B，48h對(duì)菲的降解率達(dá)到99.1﹪。 鏡檢表明菌株GY2B為革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌，16SrDNA序列分析表明其和鞘氨醇單胞菌的同源性最高，初步鑒定它為Sphingomonassp.GY2B，該菌株的GenBank登陸號(hào)是DQ139343。菌株GY2B對(duì)四種常用的

4、抗生素：頭孢呋辛、氯霉素、紅霉素和四環(huán)素表現(xiàn)敏感，對(duì)羥氨芐青霉素中度敏感。且菌株GY2B沒有明顯的質(zhì)粒DNA條帶。 菌株GY2B的最佳生長(zhǎng)溫度是25～30℃，最佳pH值范圍是7.1～7.4，對(duì)菲的降解在pH值7～10范圍內(nèi)都比較高。試驗(yàn)表明添加低濃度的蛋白胨或葡萄糖對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和菲的降解都有一定促進(jìn)作用，而葡萄糖的作用似乎更明顯一些。但高濃度葡萄糖(≥500mg/L)的加入對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生毒害作用。 當(dāng)菌株GY2B以

5、10、60和100mg/L初始濃度的菲為唯一碳源時(shí)，48h菲的降解率均在99﹪以上，而230mg/L初始濃度下菲的降解率只有70﹪左右，此后菲濃度基本不再減少，到120h仍有大量的菲殘留，此時(shí)菌株GY2B的細(xì)胞也大量死亡。進(jìn)一步研究證實(shí)了高初始濃度(250mg/L)的菲樣品中積累了一種中間產(chǎn)物——1-羥基-2-萘酸，之后的研究表明高濃度的1-羥基-2-萘酸對(duì)菌體細(xì)胞有抑制作用。另外，通過計(jì)算菌株GY2B在不同菲初始濃度下的比生長(zhǎng)速率μ(

6、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)發(fā)現(xiàn)底物菲的初始濃度和菌株的比生長(zhǎng)速率μ之間沒有顯著的相關(guān)性。 底物降解范圍實(shí)驗(yàn)表明：菌株GY2B能夠以一定濃度的萘、菲、1-羥基-2-萘酸、2-萘酚、水楊酸、鄰苯二酚、苯酚、苯和甲苯為唯一碳源和能源進(jìn)行生長(zhǎng)和繁殖，但不能利用和降解低濃度的1-萘酚、鄰苯二甲酸和對(duì)苯二酚為唯一碳源生長(zhǎng)。同時(shí)，菌株GY2B在降解水楊酸、1-羥基-2-萘酸和萘的過程中都有中間產(chǎn)物2-羥基粘康酸半醛，而降解鄰苯二酚的過程有產(chǎn)物己二烯二酸。

7、 試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)菌株雖然不能利用1-萘酚為唯一碳源生長(zhǎng)，且1-萘酚對(duì)細(xì)胞有抑制作用，但是當(dāng)一定濃度的1-萘酚和一定濃度的菲共存時(shí)，菌株GY2B能利用和降解部分的1-萘酚。 UV-Vis分析發(fā)現(xiàn)混合菌GY2和菌株GY2B降解菲的產(chǎn)物中有羥基與芳香環(huán)相連的結(jié)構(gòu)以及酚酮結(jié)構(gòu)的化合物。另外還證明菌株GY2B降解菲的過程中有1-羥基-2-萘酸和2-羥基粘康酸半醛這兩種中間產(chǎn)物的產(chǎn)生。GC-MS分析發(fā)現(xiàn)菌株GY2B代謝菲的時(shí)候有中間

8、產(chǎn)物水楊酸，1-萘酚和1-羥基-2-萘酸，以及微量的1-羥基-2-萘醛和1-羥基-2-萘酸甲酯。而混合菌GY2的代謝物中除沒有水楊酸外，其余產(chǎn)物和菌株GY2B的一樣。 通過底物降解范圍試驗(yàn)、UV-Vis和GC-MS分析，推導(dǎo)出菌株GY2B降解菲的途徑如下：在菌株GY2B的作用下，菲先開環(huán)生成1-羥基-2-萘酸甲酯和1-羥基-2-萘醛，然后轉(zhuǎn)化成1-羥基-2-萘酸，經(jīng)脫羧成為1-萘酚，再開環(huán)后生成水楊酸，通過鄰苯二酚間位途徑裂解