mba論文米曲霉工程菌中無痕缺失pfka基因促進其cbp法合成木糖醇pdf

1、 學校代碼： 10385 分類號： 研究生學號：1200215021 密 級： 米 曲 霉 米 曲 霉 工 程 菌 中 無 痕 缺 失 工 程 菌 中 無 痕 缺 失 pfkA 基 因 促 進 其 基 因 促 進 其 CBP 法 合

2、 成 木 糖 醇 法 合 成 木 糖 醇 Consolidated bioprocessing strategy for enhanced xylitol production by marker-free deleting pfkA gene in engineered Aspergillus oryzae 作者姓名： 謝桂貞 謝桂貞 指導教師： 陳宏文 陳宏文

3、 學 科： 生物化學與分子生物學 生物化學與分子生物學 研究方向： 代謝工程 代謝工程 所在學院： 化工學院 化工學院 論文提交日期：2015 年 5 月 22 日摘要 I 摘要 一體化生物加工過程 (Consolidated bioprocessing，CBP) 是指在不添加任何外源水解酶的情況下，直接將木質(zhì)纖維素原料一步轉(zhuǎn)化為生物化學品的生物加工

4、過程。CBP 已被公認為是木質(zhì)纖維素生物質(zhì)低成本水解和發(fā)酵的最終配置。米曲霉作為重要的食品安全生產(chǎn)菌，天然具備較高活力的半纖維素水解酶系和木糖分解代謝相關(guān)酶系，是實現(xiàn)半纖維素原料直接轉(zhuǎn)化木糖醇的潛在 CBP 理想菌株。本課題組前期利用分子生物學技術(shù)，缺失米曲霉木糖醇脫氫酶 XDH 基因xdh，阻斷木糖醇分解途徑，提高了木糖醇產(chǎn)量，實現(xiàn)了半纖維素直接合成木糖醇的 CBP 方式。然而，xdh 基因缺失以后，木糖醇大部分分泌到胞外，減少了PP

5、P 和 EMP 途徑代謝通量，菌株生長速度減緩。而 PPP 途徑是木糖代謝產(chǎn)生NADPH 的最主要途徑，NADPH 的缺乏，可能抑制依賴 NADPH 的木糖還原酶XR 的酶活力，成為影響木糖醇產(chǎn)量進一步提高的限制因素。 本研究在 xdh 缺失的工程菌 A. oryzae xdhD30-1 基礎上，利用篩選標記可循環(huán)利用的拉圖爾系統(tǒng)（Latour system），繼續(xù)敲除糖酵解途徑中的磷酸果糖激酶PFK 基因 pfkA，以期增加 PPP

6、途徑代謝流，提高胞內(nèi) NADPH 濃度，彌補 xdh缺失導致的 NADPH 氧化還原不平衡， 進一步提高米曲霉合成木糖醇的能力。 研究結(jié)果如下： 首先，以 A. oryzae CICC2012 基因組為模板，克隆 pfkA 基因上游 KA、KB和下游 KC 目的片段； 用 primer premier 5.0 設計引物， 引入相應的酶切位點 （Xho I、Xba I 和 Stu I），通過融合 PCR 將片段 KA、KC 和部分 pyr

7、G 融合獲得中間片段 1， 以及將部分 pyrG 和片段 KB 融合獲得中間片段 2； 再通過酶切連接轉(zhuǎn)化，獲得兩個中間片段的克隆子；最后通過 Xho I 和 Xba I 進行雙酶切連接，獲得打靶載體 pUC57-pyrG-pfkA-ABC。 然后，利用 PEG-CaCl2 介導法，將用于敲除 pfkA 基因的 打靶 載體pUC57-pyrG-pfkA-ABC 導入到 pyrG-營養(yǎng)缺陷型受體菌株 A. oryzae xdhD30-1（