大腸桿菌基因工程菌轉(zhuǎn)化半纖維素水解液生產(chǎn)木糖醇的研究.pdf

1、木糖醇是一種五碳糖醇，具有抗齲齒、代謝不依賴胰島素、改善肝功能等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化工等行業(yè)。當(dāng)前工業(yè)上生產(chǎn)木糖醇主要是利用半纖維素水解液中分離純化獲得的純木糖，在高溫高壓條件下使用鎳催化加氫制得，這種工藝條件苛刻、容易造成污染、生產(chǎn)成本較高。生物法生產(chǎn)木糖醇不需要高溫高壓條件、污染環(huán)境的鎳和高純度木糖等，所以生物法生產(chǎn)木糖醇越來(lái)越受到人們的重視。大腸桿菌作為生產(chǎn)各種高附加值化學(xué)品的理想宿主，其具有培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、能夠利用半纖維

2、素水解液中所有糖類(lèi)、生長(zhǎng)速度快、基因操作簡(jiǎn)便、蛋白表達(dá)水平高等諸多優(yōu)點(diǎn)。目前，以大腸桿菌為宿主利用半纖維素水解液生產(chǎn)木糖醇的研究已有報(bào)道，但其生產(chǎn)效率低且成本較高，和化學(xué)法相比還不具備優(yōu)勢(shì)。本論文以大腸桿菌W3110為宿主細(xì)胞，針對(duì)目前基因工程菌生產(chǎn)木糖醇存在的問(wèn)題，主要圍繞以下四個(gè)方面進(jìn)行了研究:1）在較高溫度下蛋白的高效可溶表達(dá);2）目的基因在宿主菌中遺傳穩(wěn)定性;3）生產(chǎn)過(guò)程中副產(chǎn)物阿拉伯糖醇的消除;4）工業(yè)應(yīng)用中培養(yǎng)基的廉價(jià)化。<

3、br>　　首先，為了解決在較高溫度下蛋白可溶表達(dá)問(wèn)題，我們基于質(zhì)粒載體系統(tǒng)構(gòu)建了第一代高產(chǎn)木糖醇菌株。利用質(zhì)粒載體進(jìn)行蛋白的表達(dá)，通過(guò)mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)，構(gòu)建了一個(gè)能在較高溫度下高效可溶表達(dá)的質(zhì)粒;在30℃條件下，酶活是出發(fā)菌株的5.68倍。通過(guò)敲除葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)中酶Ⅱ組分的ptsG基因，消除菌株的代謝物阻遏效應(yīng)，使菌株能同時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖和木糖;敲除菌株自身代謝木糖的基因xylA和xylB，阻斷木糖的代謝利用;敲除可轉(zhuǎn)運(yùn)木糖醇的

4、果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)中酶Ⅱ組分的ptsF基因，減少木糖醇的磷酸化;通過(guò)一系列的優(yōu)化，木糖醇生產(chǎn)效率是出發(fā)菌株的8.71倍。在實(shí)驗(yàn)室小試中，工程菌利用純木糖進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵，產(chǎn)生了172.4 g/L的木糖醇，生產(chǎn)效率為1.57 gL-1h-1，相對(duì)于葡萄糖的摩爾得率達(dá)到2.2;利用半纖維素水解液生產(chǎn)木糖醇時(shí)，產(chǎn)物濃度和生產(chǎn)效率分別達(dá)到150gL-1和1.40 g L-1 h-1。
　　接著，為了解決使用質(zhì)粒系統(tǒng)帶來(lái)的菌株遺傳不穩(wěn)定的問(wèn)

5、題，我們建立了一套基因組多拷貝整合系統(tǒng)RecA-assisted chromosomal integration(RACI)，使xr基因以特定拷貝數(shù)整合進(jìn)大腸桿菌的基因組;整個(gè)整合系統(tǒng)的核心是構(gòu)建一個(gè)含有IS5序列、R6K復(fù)制子、P43啟動(dòng)子和xr基因的載體;利用IS5序列作為整合位點(diǎn)進(jìn)行大腸桿菌基因組多拷貝整合，目的基因能在菌株內(nèi)穩(wěn)定遺傳。利用該系統(tǒng)，我們構(gòu)建了一株基因組中存在4個(gè)拷貝xr的菌株。工程菌利用純木糖進(jìn)行分批發(fā)酵時(shí)，產(chǎn)生了

6、110.1 g L-1木糖醇，生產(chǎn)效率為3.06 g L-1 h-1，此生產(chǎn)效率和使用多拷貝質(zhì)粒菌株的生產(chǎn)效率大致相當(dāng)，但其優(yōu)點(diǎn)是不需要額外添加抗生素和誘導(dǎo)劑，降低了生產(chǎn)成本。
　　進(jìn)一步，為了解決木糖醇生產(chǎn)過(guò)程中副產(chǎn)物阿拉伯糖醇的問(wèn)題，我們對(duì)木糖還原酶進(jìn)行了定點(diǎn)突變，提高其對(duì)木糖的選擇性，獲得了一個(gè)對(duì)阿拉伯糖活性降低了27倍的突變體。在搖瓶發(fā)酵中，含有此突變體的菌株在使用質(zhì)粒作為表達(dá)載體時(shí)，在產(chǎn)物中已檢測(cè)不到阿拉伯糖醇的存在;但

7、在發(fā)酵罐發(fā)酵中仍有47.34％的阿拉伯糖轉(zhuǎn)化成阿拉伯糖醇。我們發(fā)現(xiàn)使用整合型菌株（木糖還原酶酶活較低），可以顯著降低阿拉伯糖醇的產(chǎn)生，只有9.6％的阿拉伯糖轉(zhuǎn)化成阿拉伯糖醇。使用含有突變酶的整合型菌株在發(fā)酵罐中轉(zhuǎn)化半纖維素水解液生產(chǎn)木糖醇時(shí)，在產(chǎn)物中已檢測(cè)不到阿拉伯糖醇。
　　最后，為了使本工藝實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，獲得符合產(chǎn)業(yè)化需要的培養(yǎng)基組成，我們選擇工業(yè)級(jí)玉米漿干粉作為氮源，工業(yè)級(jí)葡萄糖作為碳源，半纖維素水解液作為底物，對(duì)生產(chǎn)條件進(jìn)行

8、了優(yōu)化?？疾炝藴囟葘?duì)酶活和木糖醇生產(chǎn)效率的影響，確定了菌株在30℃條件下，木糖醇的生產(chǎn)效率最高;經(jīng)過(guò)搖瓶水平的發(fā)酵條件優(yōu)化，確定了最佳底物濃度為20 g L-1，最佳底物添加時(shí)機(jī)為菌株培養(yǎng)4小時(shí)后添加。進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵時(shí)，工程茵產(chǎn)生了143.8g L-1的木糖醇，生產(chǎn)效率為1.84g L-1 h-1。
　　總之，通過(guò)本論文的系統(tǒng)研究，實(shí)現(xiàn)了重組大腸桿菌利用廉價(jià)培養(yǎng)基轉(zhuǎn)化半纖維素水解液生產(chǎn)高純度木糖醇，為木糖醇的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了堅(jiān)實(shí)