mba論文米曲霉aspergillusoryzaeaf04中甘氨酸氧化酶基因的克隆及其工程菌株構(gòu)建pdf

1、 分類號： 密級： U D C ：學(xué)號： 405605111080 南 昌 大 學(xué) 碩 士 研 究 生 學(xué) 位 論 文 米曲霉 Aspergillus oryzae A-F04 中甘氨酸氧化酶基因的克隆及其工程菌株構(gòu)建 Gene cloning of glycine oxidase from Aspergillus oryzae A-F04 and constru

2、ction of the Recombinant Engineering Strain 李浩 培養(yǎng)單位（院、 系） ： 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院 指導(dǎo)教師姓名、職稱：萬茵 副教授 申請學(xué)位的學(xué)科門類：理學(xué) 學(xué) 科 專 業(yè) 名 稱：營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué) 論 文 答 辯 日 期： 2014 年 5 月 28 日 答辯委員會主席： 評閱人： 2014 年 5 月 25 日 摘要 I 摘

3、要 本文以實(shí)驗(yàn)室前期篩選的米曲霉為出發(fā)菌株，通過液相測定不同米曲霉的草甘膦降解率； 通過相關(guān)文獻(xiàn)和 NCBI 比對初步選定甘氨酸氧化酶為米曲霉中草甘膦降解酶； 提取不同米曲霉菌株的 DNA，通過 PCR 得到甘氨酸氧化酶的基因序列，并通過軟件進(jìn)行序列分析；選擇降解能力最強(qiáng)的米曲霉為出發(fā)菌株，提取 DNA，進(jìn)行基因組 DNA 的 PCR，得到甘氨酸氧化酶基因序列，通過基因工程技術(shù)，將其導(dǎo)入畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中，得到含甘氨酸氧化酶基因的畢赤酵

4、母工程菌株。 現(xiàn)將本文主要研究結(jié)論概況如下： 1. 采用液相色譜法測定不同米曲霉菌株的草甘膦降解率，降解率最強(qiáng)的為米曲霉(Aspergillus oryzae)A-F04,達(dá)到 12.5%。 2. 提取不同米曲霉菌株的 DNA，PCR 擴(kuò)增后得到不同的甘氨酸氧化酶序列， 測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有米曲霉 A-F04 發(fā)生基因突變。 米曲霉 （Aspergillus oryzae）A-F04 的 ORF DNA 序列全長 1263bp， 編碼一個(gè)由

5、 420aa 組成的蛋白質(zhì)， 其理論分子量為 102933.4 Da，理論等電點(diǎn)為 5.03，是一個(gè)弱酸性蛋白。米曲霉（Aspergillus oryzae）A-F04 編碼的甘氨酸氧化酶有 96%的同源性，兩者相差 16個(gè)氨基酸。對該氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域架構(gòu)分析結(jié)果表明該序列具有明顯的 D-氨基酸氧化酶結(jié)構(gòu)域，并且發(fā)現(xiàn)了與 FAD 上腺膘呤結(jié)合的六肽基序。 3. 在培養(yǎng)基中添加草甘膦和正常組相比發(fā)現(xiàn)：在含草甘膦的發(fā)酵培養(yǎng)基中生長的米曲

6、霉菌絲體個(gè)數(shù)少并且個(gè)體較大，正常組菌絲體數(shù)目多而小，表明草甘膦對米曲霉有一定的毒性作用，抑制米曲霉孢子萌發(fā)。 4. 提取 DNA，進(jìn)行基因組 DNA 的 PCR，得到甘氨酸氧化酶基因序列，通過限制性內(nèi)切酶 EcoR I 和 Not I， 將切膠回收純化的 PCR 產(chǎn)物和畢赤酵母表達(dá)載體 pPlC9K 分別進(jìn)行雙酶切，并將酶切產(chǎn)物進(jìn)行酶連，將酶連產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，通過氨芐青霉抗性篩選和 PCR 鑒定，最終得到重組質(zhì)粒p