芒果(mangiferaindical.)生長素反應(yīng)因子類基因miarf2在不定根誘導(dǎo)時(shí)的功能研究

1、中山大學(xué)博士學(xué)位論文芒果（Mangifera indica L.）生長素反應(yīng)因子類基因MiARF2在不定根誘導(dǎo)時(shí)的功能研究姓名：陳啟助申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：生物技術(shù)指導(dǎo)教師：黃學(xué)林20080605芒果( M a n g i f e r a i n d i c a L ．) 生長素反應(yīng)因子類基因M i A R F 2 在不定根誘導(dǎo)時(shí)的功能研究本文旨在進(jìn)一步揭示M i A R F 2 基因在芒果子葉切段不定根形成時(shí)的有關(guān)功能，主要的研究結(jié)

2、果如下：本研究通過S o u t h e r n 雜交分析了其拷貝數(shù)，發(fā)現(xiàn)M i A R F 2 基因在芒果基因組中是一個單拷貝基因。通過構(gòu)建原核表達(dá)載體p E T - 3 2 a - M i A R F 2 ，將M i A R F 2 轉(zhuǎn)入大腸桿菌，研究了該基因的表達(dá)活性，得到了M i A R F 2 基因的可溶性融合蛋白。利用R T - P C R 技術(shù)初步分析了M i A R F 2 基因在芒果子葉切段第一種類型不定根形成過程中的

3、表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在不定根的發(fā)端階段( 不定根誘導(dǎo)7 d 后) ，M i A R F 2 基因開始在近胚軸面表達(dá)，不定根誘導(dǎo)的生長分化階段( 誘導(dǎo)1 0 d 時(shí))表達(dá)量增強(qiáng)。而在幼嫩的根尖及遠(yuǎn)胚軸面，不定根誘導(dǎo)的各個時(shí)段都檢測不到M i A R F 2 基因的表達(dá)。同時(shí)利用實(shí)時(shí)定量P C R ( R e a l ．T i m eP C R ) 技術(shù)進(jìn)一步對M i A R F 2 基因在芒果子葉切段兩種類型不定根形成的各個階段的表達(dá)情況

4、進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，在芒果子葉切段第一種類型不定根發(fā)生過程中，M i A R F 2 基因只在近胚軸面表達(dá)，不定根誘導(dǎo)7 d 后( 不定根的發(fā)端階段) 其表達(dá)量開始增加；誘導(dǎo)1 0 d 時(shí)( 發(fā)育階段) 表達(dá)量達(dá)到頂峰，約為本底水平的7 倍；誘導(dǎo)1 3 d ( 不定根突破表皮) 時(shí)，M i A R F 2 基因的表達(dá)量回落到本底水平。在芒果子葉第二種類型不定根發(fā)生過程中，M 謝尺力基因在背面表達(dá)，其表達(dá)趨勢與第一種類型不定根發(fā)生時(shí)相似

5、。而在芒果子葉的兩種類型不定根發(fā)生過程中，M i A R F 2 基因在子葉遠(yuǎn)胚軸面幾乎都不表達(dá)。由此可見，M i A R F 2 基因主要在不定根的根原基的發(fā)端及其發(fā)育階段中起作用。采用熒光原位雜交的方法研究了M i A R F 2 基因在芒果子葉切面生根時(shí)的組織學(xué)的表達(dá)特性。結(jié)果顯示，在誘導(dǎo)7 d 后M i A R F 2 基因只在芒果子葉近胚軸面的維管束部位表達(dá)，主要在分泌腔外層的上皮細(xì)胞和韌皮部薄壁細(xì)胞中表達(dá)。這與我們先前的組織

6、學(xué)切片觀察發(fā)現(xiàn)不定根起源于芒果子葉維管束韌皮部的薄壁細(xì)胞相吻合。為了通過觀察轉(zhuǎn)基因煙草的表型變化探討M i A R F 2 基因在不定根形成中的功能，本研究還構(gòu)建了M i A R F 2 基因的植物表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)將其轉(zhuǎn)入煙草( N i c o t i a n at a b a c u m 刪X a n t h i ) 。對轉(zhuǎn)基因煙草植株不定根根長的表型分析發(fā)現(xiàn)，在固體培養(yǎng)基和水培溶液中，轉(zhuǎn)p 3 5 S ：M i A R F