芒果(mangiferaindical.)生長素反應因子類基因miarf2在不定根誘導時的功能研究

1、中山大學博士學位論文芒果（Mangifera indica L.）生長素反應因子類基因MiARF2在不定根誘導時的功能研究姓名：陳啟助申請學位級別：博士專業(yè)：生物技術指導教師：黃學林20080605芒果( M a n g i f e r a i n d i c a L ．) 生長素反應因子類基因M i A R F 2 在不定根誘導時的功能研究本文旨在進一步揭示M i A R F 2 基因在芒果子葉切段不定根形成時的有關功能，主要的研究結

2、果如下：本研究通過S o u t h e r n 雜交分析了其拷貝數(shù)，發(fā)現(xiàn)M i A R F 2 基因在芒果基因組中是一個單拷貝基因。通過構建原核表達載體p E T - 3 2 a - M i A R F 2 ，將M i A R F 2 轉入大腸桿菌，研究了該基因的表達活性，得到了M i A R F 2 基因的可溶性融合蛋白。利用R T - P C R 技術初步分析了M i A R F 2 基因在芒果子葉切段第一種類型不定根形成過程中的

3、表達情況。結果顯示，在不定根的發(fā)端階段( 不定根誘導7 d 后) ，M i A R F 2 基因開始在近胚軸面表達，不定根誘導的生長分化階段( 誘導1 0 d 時)表達量增強。而在幼嫩的根尖及遠胚軸面，不定根誘導的各個時段都檢測不到M i A R F 2 基因的表達。同時利用實時定量P C R ( R e a l ．T i m eP C R ) 技術進一步對M i A R F 2 基因在芒果子葉切段兩種類型不定根形成的各個階段的表達情況

4、進行了研究，結果表明，在芒果子葉切段第一種類型不定根發(fā)生過程中，M i A R F 2 基因只在近胚軸面表達，不定根誘導7 d 后( 不定根的發(fā)端階段) 其表達量開始增加；誘導1 0 d 時( 發(fā)育階段) 表達量達到頂峰，約為本底水平的7 倍；誘導1 3 d ( 不定根突破表皮) 時，M i A R F 2 基因的表達量回落到本底水平。在芒果子葉第二種類型不定根發(fā)生過程中，M 謝尺力基因在背面表達，其表達趨勢與第一種類型不定根發(fā)生時相似

5、。而在芒果子葉的兩種類型不定根發(fā)生過程中，M i A R F 2 基因在子葉遠胚軸面幾乎都不表達。由此可見，M i A R F 2 基因主要在不定根的根原基的發(fā)端及其發(fā)育階段中起作用。采用熒光原位雜交的方法研究了M i A R F 2 基因在芒果子葉切面生根時的組織學的表達特性。結果顯示，在誘導7 d 后M i A R F 2 基因只在芒果子葉近胚軸面的維管束部位表達，主要在分泌腔外層的上皮細胞和韌皮部薄壁細胞中表達。這與我們先前的組織

6、學切片觀察發(fā)現(xiàn)不定根起源于芒果子葉維管束韌皮部的薄壁細胞相吻合。為了通過觀察轉基因煙草的表型變化探討M i A R F 2 基因在不定根形成中的功能，本研究還構建了M i A R F 2 基因的植物表達載體，通過農(nóng)桿菌介導將其轉入煙草( N i c o t i a n at a b a c u m 刪X a n t h i ) 。對轉基因煙草植株不定根根長的表型分析發(fā)現(xiàn)，在固體培養(yǎng)基和水培溶液中，轉p 3 5 S ：M i A R F