番茄生長素反應(yīng)基因的分離與表達(dá)分析及SlARF5基因功能的初步研究.pdf

1、作為第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的植物激素，生長素在植物生長發(fā)育的各個(gè)階段都發(fā)揮著巨大的作用。ARF(Anxin Response Factor)作為一種轉(zhuǎn)錄因子，在生長素信號(hào)傳導(dǎo)中起著關(guān)鍵的作用。ARF編碼的蛋白可以通過與生長素反應(yīng)基因啟動(dòng)子區(qū)域的生長素反應(yīng)原件結(jié)合來調(diào)節(jié)這些基因的表達(dá)。AUX/IAA基因家族的基因編碼的蛋白質(zhì)在生長素信號(hào)傳導(dǎo)的過程中通過與ARF基因結(jié)合抑制其作用來調(diào)控基因表達(dá)。IAA，GH3和SAUR基因的mRNA水平可以迅速被生長

2、素所誘導(dǎo)，因此被稱為生長素原初反應(yīng)基因。在不時(shí)栽培中，在開花結(jié)果期如遇逆溫（低溫或高溫）就會(huì)發(fā)生授粉受精不良，落花落果等現(xiàn)象，直接導(dǎo)致坐果率下降，畸形果數(shù)量增加，嚴(yán)重影響到番茄的產(chǎn)量和品質(zhì)。而前人的研究表明，生長素相關(guān)基因特別是ARF和AUX/IAA基因在番茄果實(shí)的單性結(jié)實(shí)中發(fā)揮著重要的作用。因此，對(duì)番茄生長索相關(guān)基因的全基因組分析必將為以后研究每個(gè)基因的功能以及進(jìn)一步應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)踐提供依據(jù)。
　　 本研究主要以番茄Micro-

3、Tom品種作為研究對(duì)象，主要研究生長素相關(guān)的基因在番茄幼果發(fā)育過程中的時(shí)空表達(dá)特性，構(gòu)建SIARF5的Artificial MirRNA植物表達(dá)載體并進(jìn)行轉(zhuǎn)基因工作，獲得了番茄轉(zhuǎn)基因植株并初步分析S1ARF5在番茄坐果以及果實(shí)發(fā)育過程中的作用。本研究旨在探討生長素調(diào)控植物果實(shí)坐果和果實(shí)發(fā)育的分子機(jī)制，為在生產(chǎn)上解決番茄坐果不良等問題尋求重要理論依據(jù)。
　　 主要研究結(jié)果如下:
　　 (1)通過搜集其它物種中已經(jīng)公布的AR

4、F基因的氨基酸序列在番茄基因組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行TBLASN的同源比對(duì)。將比對(duì)后得到的DNA序列預(yù)測(cè)去除內(nèi)含子后再通過一系列的包括電子克隆和分子克隆的方法共分離出21個(gè)番茄ARF基因。這些基因的堿基序列長度從1218bp(S1ARF12)到3372bp(S1ARF7)不等。21個(gè)基因分布在除了9號(hào)以外的所有的11條染色體上。大部分的番茄ARF基因包含了DBD、MR和CTD三個(gè)功能域。但是S1ARF3,6-1，12-14,13-1和17這7個(gè)基

5、因缺失了第三個(gè)功能域。進(jìn)化分析表明21個(gè)基因可以分為Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ三組。其中組Ⅰ和組Ⅱ可以進(jìn)一步細(xì)分。表達(dá)分析表明S1ARF基因在植株的各個(gè)部位表達(dá)差異不大，為組成型表達(dá)。在花蕊的發(fā)育過程中表現(xiàn)出多樣化的表達(dá)模式。在子房的發(fā)育過程中，但部分的基因呈現(xiàn)出先升高后下降的表達(dá)模式，但是S1ARF4則是持續(xù)升高。
　　 (2)通過與(1)中相同的方法，從番茄基因組中一共鑒定出了26個(gè)AUX/IAA基因。這些基因的堿基長度從228bp(S1I

6、AA13)到1050bp(S1IAA4)不等。26個(gè)基因分布在除了2號(hào)，10號(hào)和11號(hào)之外的所有的9條染色體上。大部分的番茄IAA基因包含了所有的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ四個(gè)功能域，但是S1IAA13、15、16、18、20和27則缺失了第Ⅰ和Ⅱ兩個(gè)功能域。進(jìn)化分析表明，所有的26個(gè)S1IAA因可以細(xì)分為A和B兩組，這兩組還可以分別細(xì)分成5和3個(gè)小組。S1I從基因在植株不同部位的表達(dá)差異較大，表達(dá)模式比較特異。在花蕊的發(fā)育過程中除了個(gè)別的基因(S

7、1IAA16、20、23和24)都表現(xiàn)出持續(xù)上升的模式。而在果實(shí)的發(fā)育過程中則表現(xiàn)出了多樣化的表達(dá)模式。在激素處理之后，大部分的S1IAA基因都可以被生長素誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，但是S1IAA19和20的表達(dá)卻被IAA抑制。在逆境條件下，大部分的S1IAA的表達(dá)情況都有變化，但是變化的程度各不相同。
　　 (3)用類似的方法從番茄數(shù)據(jù)庫中鑒定出了32個(gè)番茄GH3基因。在這32個(gè)基因中有一半左右的成員是長度較小的基因。這是在以前的研究中沒

8、有報(bào)道過的。這32個(gè)基因分布在除了3號(hào)、4號(hào)、9號(hào)和11號(hào)之外的所有的8條染色體上，其中有5個(gè)(S1GH3.28-32)在已經(jīng)拼接的基因組數(shù)據(jù)庫中未找到確切的位置。按照前人的報(bào)道，這些基因按照進(jìn)化關(guān)系可以分成Ⅰ和Ⅱ兩組。對(duì)12條S1GH3進(jìn)行表達(dá)分析表明，GH3在植株的不同部位的表達(dá)也是比較特異的?；ㄈ锏陌l(fā)育過程中，不同基因的表達(dá)模式差異較大。而在子房的發(fā)育過程中均呈現(xiàn)出先增長后下降的表達(dá)模式。大部分的S1GH3基因?qū)ιL素的處理不敏感

9、，只有GH3.18的表達(dá)在處理前后表現(xiàn)出了明顯的差異。
　　 (4)用類似的方法從番茄數(shù)據(jù)庫中鑒定出了99個(gè)番茄SAUR基因。這些基因堿基的長度在186bp(S1SAUR30)到597bp(S1SAUR54)之間。大部分的基因都簇狀分布在所有的12條染色體上。將所有已經(jīng)公布的SAUR基因以及本研究中新鑒定出來的SAUR基因進(jìn)行進(jìn)化分析，所有的484個(gè)SAUR基因可以分為A、B、C和D四個(gè)大組，以及進(jìn)一步細(xì)分成16個(gè)小組。S1SA

10、UR基因在植株的不同部位表達(dá)差異明顯。在子房和花蕊的發(fā)育過程中，不同基因的表達(dá)模式差異較大。從已經(jīng)公布的所有的SAUR基因的氨基酸序列中，我們找到了26個(gè)基因含有組氨酸富集的區(qū)域。特別需要指出的是，S1SAUR58作為一個(gè)番茄中組氨酸含量最高的SAUR基因，它的表達(dá)可以被干旱脅迫和高溫脅迫抑制，但是卻被鹽脅迫所誘導(dǎo)。S1SAUR也可以明顯的被生長素誘導(dǎo)表達(dá)。這些證據(jù)表明S1SAUR58在連接生長素信號(hào)和鹽脅迫信號(hào)中可能發(fā)揮著特殊的作用。

11、
　　 (5)構(gòu)建了S1ARF5的人工MirRNA植物表達(dá)載體。首先以擬南芥中的miR164a作為骨架，用S1ARF5的特異片段替換掉miR164a上的成熟MirRNA序列。MiR164a至今沒有報(bào)道會(huì)與ARF互作，排出了番茄中miR164a會(huì)與S1ARF5互作的可能。然后將合成的Artificial MirRNA連接入雙元載體pCAMBIA1301-35s，命名為P35s:1031ArtmirRNA ARF5。以pCAMBIM