花生納米肽制備與吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究.pdf

1、我國(guó)有著豐富的花生蛋白資源，每年約有180萬(wàn)噸花生蛋白有待高值化利用，花生短肽開(kāi)發(fā)成為花生蛋白深加工的研究熱點(diǎn)。針對(duì)當(dāng)前花生短肽功能活性不高，生物利用度低的現(xiàn)狀，本論文開(kāi)展了HPM預(yù)處理解聚花生分離蛋白制備高活性短肽及其機(jī)制研究，構(gòu)建了短肽-脂質(zhì)體納米運(yùn)載體系，分析了運(yùn)載體系穩(wěn)定機(jī)制，進(jìn)行了模擬消化、吸收轉(zhuǎn)運(yùn)研究，探討了運(yùn)載體系對(duì)于花生短肽的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。
　　通過(guò)分析HPM處理不同壓力下花生分離蛋白水力學(xué)直徑、分子量分布和微觀結(jié)構(gòu)的

2、變化，發(fā)現(xiàn)花生分離蛋白在水分散系中處理壓力≤120MPa時(shí)解聚，壓力＞120MPa時(shí)聚集。進(jìn)一步分析了花生蛋白的表面疏水指數(shù)、巰基/二硫鍵、zeta電位等穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用力在不同壓力下變化，探究了花生分離蛋白在水分散系中的解聚/聚集機(jī)制，明確了花生分離蛋白在水分散系中的變化是靜電相互作用與疏水相互作用、氫鍵和二硫鍵綜合作用的結(jié)果。
　　以上述解聚/聚集機(jī)制為理論基礎(chǔ)，確定了適宜HPM壓力120MPa，循環(huán)處理3次，濃度為6％條

3、件下，可獲得花生分離蛋白最大程度展開(kāi)；采用Neutrase和Protamex雙中性蛋白酶對(duì)解聚的花生分離蛋白進(jìn)行酶解，獲得的酶解產(chǎn)物氮溶指數(shù)達(dá)到82.39±4.82%，Mw＜1KDa的短肽比例達(dá)到95.39±2.82%，同時(shí)表面疏水指數(shù)、ACE抑制活性和DPPH自由基清除率均顯著高于對(duì)照。通過(guò)HPM處理和普通工藝所獲得酶解產(chǎn)物對(duì)比，證實(shí)了HPM優(yōu)化工藝可以有效的打開(kāi)PPI內(nèi)部埋藏的疏水基團(tuán)，影響PPI酶解產(chǎn)物構(gòu)成，促進(jìn)功能活性的增強(qiáng)。<

4、br>　　將HPM改性花生分離蛋白的酶解產(chǎn)物進(jìn)行離心、超濾處理后獲得了Mw＜1KDa的花生短肽。花生短肽溶解性為97.50±2.31mg/mL，平均疏水性為3.35KJ/mol，具有強(qiáng)親水性特征；在水溶液中呈明顯的聚集狀態(tài)，粒徑為22.6±2.2nm，為典型的納米結(jié)構(gòu)短肽。
　　根據(jù)獲得花生短肽的理化性質(zhì)開(kāi)展了脂質(zhì)體包封短肽技術(shù)研究，確定了以甲醇和三氯甲烷為破乳劑，采用超濾離心法測(cè)定包封率，采取響應(yīng)面法優(yōu)化了脂質(zhì)體壁材組成，確定壁

5、材組成為卵磷脂：短肽11.46，卵磷脂：膽固醇9.52，卵磷脂：脫氧膽酸鈉4.40，卵磷脂濃度4.21mg/mL，制備脂質(zhì)體的包封率為57.49±2.48%；進(jìn)一步采用HPM處理制備納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)體，確定120MPa處理4次可獲得包封率為59.65±2.81%的納米脂質(zhì)體。
　　HPM處理會(huì)造成脂質(zhì)體包封率下降，而120MPa處理時(shí)則與粗脂質(zhì)體無(wú)顯著差異，通過(guò)分析包封率和觀察脂質(zhì)體不同壓力處理下微觀結(jié)構(gòu)變化，闡明了120MPa HP

6、M處理壓力下脂質(zhì)體包封率的保持機(jī)制，發(fā)現(xiàn)120MPa處理后脂質(zhì)體發(fā)生有限聚集，形成了類(lèi)多層脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生了多個(gè)脂質(zhì)體包裹的水性?xún)?nèi)核，可以將親水性短肽包封，阻止其遷移到外水相中；而疏水性短肽也因脂質(zhì)體聚集作用，增加了留在脂質(zhì)體中的機(jī)會(huì)，因而導(dǎo)致包封率的增大。
　　通過(guò)分析納米脂質(zhì)體貯藏過(guò)程中粒徑和包封率變化，發(fā)現(xiàn)明顯存在Ostwald熟化現(xiàn)象，分析其對(duì)包封率的影響機(jī)制發(fā)現(xiàn)，貯藏過(guò)程中脂質(zhì)體粒徑呈繼發(fā)性增長(zhǎng)，有限聚集持續(xù)增加，包封率

7、因而得到提高，利用這一特性，采取室溫下50rpm低速攪拌24h，將納米脂質(zhì)體的包封率提升至82.21±4.58%，利用脂質(zhì)體、短肽之間的相互作用構(gòu)建完成了花生短肽-脂質(zhì)體納米運(yùn)載體系。
　　分析了運(yùn)載體系的理化性質(zhì)和穩(wěn)定性，酸堿環(huán)境下穩(wěn)定性良好，pH2.0時(shí)的泄漏率最高為12.53±0.53%；但其耐熱能力較差，37℃以下時(shí)有較好的穩(wěn)定性，達(dá)到巴氏殺菌溫度時(shí)泄漏率達(dá)90%以上；分析了短肽的體外釋放率，36h體外釋放率為59.21±

8、2.67%，具有良好的體外緩釋性；體外模擬消化后ACE抑制活性保持穩(wěn)定，游離脂肪酸釋放率18.97±0.78%，表現(xiàn)了良好的消化穩(wěn)定性。
　　納米脂質(zhì)體模擬消化過(guò)程中基本保持了完整的結(jié)構(gòu)形態(tài)，而粗脂質(zhì)體則破損嚴(yán)重，通過(guò)對(duì)比模擬消化前后脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)和性質(zhì)差異，明晰了花生短肽-脂質(zhì)體納米運(yùn)載體系的穩(wěn)定機(jī)制，其主要原因?yàn)镠PM處理導(dǎo)致了脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)重組，因而納米脂質(zhì)體更能抵御胃腸道嚴(yán)苛環(huán)境。
　　以Caco-2單層細(xì)胞為模型，進(jìn)一步開(kāi)