雞蛋主要蛋白及氨基酸調控CacO-2細胞膽固醇吸收轉運及其機理研究.pdf

1、雞蛋膽固醇的攝入與人體血清膽固醇的濃度是否呈正相關性一直是一個具有爭議性的問題。針對這一問題本研究以雞蛋的主要蛋白質為研究對象，通過細胞實驗研究其對膽固醇吸收的影響。通過分子生物學的技術手段探究雞蛋蛋白質對膽固醇代謝通路的調控作用。具體研究內容和研究結果如下:
　　(1)建立一種新的快速培養(yǎng)Caco-2單細胞層的方法，分別研究細胞跨膜電阻值(TEER)、親水標志物的滲透性、關鍵蛋白基因的表達、細胞膜特征形態(tài)等評價模型的完整性。發(fā)現

2、快速培養(yǎng)法(9 d)獲得的Caco-2模型跨膜電阻值(TEER)＞220Ω·cm2;漏出標志物熒光黃表觀分配系數為(0.39±0.15)×10-6 cm/s; Apical堿性磷酸酶（AKP）活性顯著升高，培養(yǎng)至第9d時Apical/Basolateral的AKP比值為5.481±0.5304單細胞層極性分化明顯;細胞模上的關鍵蛋白質mRNA轉錄水平同標準培養(yǎng)法無顯著差異。此法建立的細胞模型縮短培養(yǎng)時間57％，僅培養(yǎng)9d即可形成完整細胞

3、模型。
　　(2)探究雞蛋主要蛋白質對膽固醇吸收轉運的調控作用。運用CCK-8法測定OVA、OTf、 OV、酪蛋白對Caco-2細胞活性的影響。將Caco-2細胞分別與OVA、OTf、 OV、酪蛋白孵育然后進行細胞吸收實驗，實驗結果表明雞蛋蛋白質孵育后的顯著抑制Caco-2細胞對膽固醇的吸收;在Transwell12孔板上培養(yǎng)Caco-2細胞模擬小腸上皮細胞，研究了雞蛋蛋白質對膽固醇轉運的影響，結果表明加入OVA、OTf能抑制了膽

4、固醇的轉運而OV對膽固醇的轉運沒有影響。
　　(3)研究三種蛋白對微膠混合液中膽固醇溶解度的影響;對膽固醇吸收通路中關鍵蛋白NPC1L1表達量的影響;對關鍵基因ABCG5/G8、ACAT2、MTP、ABCA1、SREBP1與SREBP2的轉錄水平的影響。結果發(fā)現OVA、OTf均能降低膽固醇的溶解度，OV無顯著的抑制效果;加入蛋白質之后Caco-2細胞中NPC1L1蛋白的翻譯量顯著的減少;采用RT-qPCR檢測了細胞中ABCG5/G

5、8、ACAT2、MTP、ABCA1、SREBP1與SREBP2的轉錄水平。OVA、OTf、OV可以上調ABCG5/G8、ABCA1的mRNA表達量，下調MTP的轉錄水平。
　　(4)研究氨基酸對膽固醇在微膠束中溶解度的影響，探究氨基酸對Caco-2細胞單層模型膽固醇的吸收調控作用，探索膽固醇吸收通路中關鍵基因轉錄語翻譯水平表達的變化。絲氨酸濃度為50μg/mL和半胱氨酸的添加濃度為100μg/mL時膽固醇在混合微膠束中的濃度顯著下