雞蛋主要蛋白及氨基酸調(diào)控CacO-2細(xì)胞膽固醇吸收轉(zhuǎn)運(yùn)及其機(jī)理研究.pdf

1、雞蛋膽固醇的攝入與人體血清膽固醇的濃度是否呈正相關(guān)性一直是一個(gè)具有爭(zhēng)議性的問(wèn)題。針對(duì)這一問(wèn)題本研究以雞蛋的主要蛋白質(zhì)為研究對(duì)象，通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究其對(duì)膽固醇吸收的影響。通過(guò)分子生物學(xué)的技術(shù)手段探究雞蛋蛋白質(zhì)對(duì)膽固醇代謝通路的調(diào)控作用。具體研究?jī)?nèi)容和研究結(jié)果如下:
　　(1)建立一種新的快速培養(yǎng)Caco-2單細(xì)胞層的方法，分別研究細(xì)胞跨膜電阻值(TEER)、親水標(biāo)志物的滲透性、關(guān)鍵蛋白基因的表達(dá)、細(xì)胞膜特征形態(tài)等評(píng)價(jià)模型的完整性。發(fā)現(xiàn)

2、快速培養(yǎng)法(9 d)獲得的Caco-2模型跨膜電阻值(TEER)＞220Ω·cm2;漏出標(biāo)志物熒光黃表觀分配系數(shù)為(0.39±0.15)×10-6 cm/s; Apical堿性磷酸酶（AKP）活性顯著升高，培養(yǎng)至第9d時(shí)Apical/Basolateral的AKP比值為5.481±0.5304單細(xì)胞層極性分化明顯;細(xì)胞模上的關(guān)鍵蛋白質(zhì)mRNA轉(zhuǎn)錄水平同標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)法無(wú)顯著差異。此法建立的細(xì)胞模型縮短培養(yǎng)時(shí)間57％，僅培養(yǎng)9d即可形成完整細(xì)胞

3、模型。
　　(2)探究雞蛋主要蛋白質(zhì)對(duì)膽固醇吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控作用。運(yùn)用CCK-8法測(cè)定OVA、OTf、 OV、酪蛋白對(duì)Caco-2細(xì)胞活性的影響。將Caco-2細(xì)胞分別與OVA、OTf、 OV、酪蛋白孵育然后進(jìn)行細(xì)胞吸收實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明雞蛋蛋白質(zhì)孵育后的顯著抑制Caco-2細(xì)胞對(duì)膽固醇的吸收;在Transwell12孔板上培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞模擬小腸上皮細(xì)胞，研究了雞蛋蛋白質(zhì)對(duì)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，結(jié)果表明加入OVA、OTf能抑制了膽

4、固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)而OV對(duì)膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)沒(méi)有影響。
　　(3)研究三種蛋白對(duì)微膠混合液中膽固醇溶解度的影響;對(duì)膽固醇吸收通路中關(guān)鍵蛋白NPC1L1表達(dá)量的影響;對(duì)關(guān)鍵基因ABCG5/G8、ACAT2、MTP、ABCA1、SREBP1與SREBP2的轉(zhuǎn)錄水平的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)OVA、OTf均能降低膽固醇的溶解度，OV無(wú)顯著的抑制效果;加入蛋白質(zhì)之后Caco-2細(xì)胞中NPC1L1蛋白的翻譯量顯著的減少;采用RT-qPCR檢測(cè)了細(xì)胞中ABCG5/G

5、8、ACAT2、MTP、ABCA1、SREBP1與SREBP2的轉(zhuǎn)錄水平。OVA、OTf、OV可以上調(diào)ABCG5/G8、ABCA1的mRNA表達(dá)量，下調(diào)MTP的轉(zhuǎn)錄水平。
　　(4)研究氨基酸對(duì)膽固醇在微膠束中溶解度的影響，探究氨基酸對(duì)Caco-2細(xì)胞單層模型膽固醇的吸收調(diào)控作用，探索膽固醇吸收通路中關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄語(yǔ)翻譯水平表達(dá)的變化。絲氨酸濃度為50μg/mL和半胱氨酸的添加濃度為100μg/mL時(shí)膽固醇在混合微膠束中的濃度顯著下