牦牛腦p53適應(yīng)高原低氧的分子機(jī)理.pdf

1、作為“高原之舟”，牦牛是唯一適應(yīng)青藏高原高寒、低氧、枯草期漫長(zhǎng)等極端生境的大型哺乳動(dòng)物（海拔4,000米以上）。腦是對(duì)環(huán)境氧最敏感的器官，其重量?jī)H為總體重的2-5％，但消耗的氧卻高達(dá)總耗氧量的20%。p53作為經(jīng)典的腫瘤抑制因子，在調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)、DNA修復(fù)、細(xì)胞死亡、細(xì)胞生存、衰老、分化、干細(xì)胞重編程和代謝等方面發(fā)揮著重要作用。但到目前為止，在國(guó)內(nèi)外尚未見到任何有關(guān)牦牛腦p53相關(guān)的研究報(bào)道。因此，為了探討青藏高原動(dòng)物對(duì)其極端低

2、氧生境適應(yīng)的分子機(jī)理，本論文以牦牛腦為研究對(duì)象，以p53的結(jié)構(gòu)、表達(dá)及其功能特征為突破口，運(yùn)用基因克隆、載體構(gòu)建、細(xì)胞培養(yǎng)、基因過表達(dá)、RT-PCR、免疫組化、免疫熒光和Western blotting等技術(shù)，系統(tǒng)分析了牦牛腦p53對(duì)其極端低氧生境適應(yīng)的分子機(jī)理。
　　結(jié)果
　　1.基因克隆和生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，牦牛p53CDS全長(zhǎng)序列與黃牛的相同，均長(zhǎng)1161bp，編碼386個(gè)氨基酸；其堿基序列同源性為99.74%，僅

3、存在一個(gè)氨基酸位點(diǎn)的差異，即牦牛的第106位氨基酸為組氨酸，而黃牛的為谷氨酰胺。牦牛p53氨基酸序列與黃牛、藏羚羊、大鼠及小鼠的同源性均較高，分別為99%、95%、74%和73%，且牦牛和藏羚羊同一位點(diǎn)氨基酸均為組氨酸，而黃牛、大鼠和小鼠的均為谷氨酰胺。
　　2.qRT-PCR定量分析表明，牦牛大腦皮質(zhì)和海馬中p53mRNA分別是黃牛的1.04和1.18倍。免疫組化及免疫熒光結(jié)果表明牦牛、黃牛的大腦皮質(zhì)和海馬中均有p53蛋白表達(dá)，

4、在大腦皮質(zhì)中p53免疫陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物主要在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞胞漿中，在海馬組織中，p53主要表達(dá)在錐體細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中。免疫組化和Western blotting定量分析表明p53蛋白在牦牛大腦皮質(zhì)和海馬中的表達(dá)量均高于黃牛的（P大腦皮質(zhì)＜0.05；P海馬>0.05）。
　　3.基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)建模分析表明，在低氧脅迫下，p53被激活并通過調(diào)控AMPK、mTOR和p21等多個(gè)靶基因參與調(diào)節(jié)多條信號(hào)通路，最終調(diào)控細(xì)胞蛋白合成、生長(zhǎng)自噬、凋亡

5、、血管生成和糖代謝等生命進(jìn)程。
　　4.p53調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)分析，1）qRT-PCR定量分析表明，在牦牛大腦皮質(zhì)中，p53調(diào)控相關(guān)基因GLUT1、GLUT3、TIGAR、PGAM1、HK2、SCO2、G6PD、HIF-1α、ET-1、VEGF、AMPK和mTOR mRNA的表達(dá)分別是黃牛的0.73、1.20、1.03、1.18、0.70、0.49、0.41、0.25、0.75、3、1.25和0.75倍。2）免疫組化和免疫熒光定位

6、和半定量分析表明，牦牛和黃牛大腦皮質(zhì)及海馬中VEGF、ET-1、mTOR、AMPK和HIF-1α蛋白的分布特征基本相同，而免疫陽(yáng)性產(chǎn)物的分布面積和累積光密度存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。牦牛大腦皮質(zhì)及海馬中VEGF和ET-1免疫陽(yáng)性產(chǎn)物的IOD值均高于黃牛的（P大腦皮質(zhì)＜0.05，P海馬＜0.001）；牦牛大腦皮質(zhì)及海馬中HIF-1α免疫陽(yáng)性產(chǎn)物的IOD值均高于黃牛的（P大腦皮質(zhì)＜0.05，P海馬＜0.01）；牦牛大腦皮質(zhì)中mTOR和AMPK免疫陽(yáng)性

7、產(chǎn)物IOD值高于黃牛（PmTOR＜0.05，PAMPK＜0.01），海馬組織中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。
　　5.功能試驗(yàn)分析表明，在常氧狀態(tài)下，牦牛p53的過表達(dá)與黃牛的相似均能下調(diào)HIF-1α蛋白的表達(dá)，降低Bcl-2/Bax值；低氧狀態(tài)下，Bcl-2/Bax的比值較常氧狀態(tài)下的下降趨勢(shì)更加明顯，但牦牛的較黃牛的下降趨勢(shì)小。
　　結(jié)論
　　1.在高原低氧適應(yīng)中，p53全長(zhǎng)CDS第106位獨(dú)特的氨基酸結(jié)構(gòu)特征（牦牛和藏羚羊p53

8、第106位均為組氨酸，而黃牛、人和小鼠的均為谷氨酰胺）是牦牛腦細(xì)胞對(duì)其低氧生境適應(yīng)的重要機(jī)制之一，但其具體的功能特征有待深層次探究。
　　2.在高原低氧適應(yīng)中，p53的高表達(dá)特征（牦牛腦p53mRNA和蛋白的表達(dá)水平均高于低海拔物種黃牛的）是牦牛腦細(xì)胞對(duì)其低氧生境適應(yīng)的重要機(jī)制之一，但其具體的調(diào)控機(jī)理有待深層次探究。
　　3.在高原低氧適應(yīng)中，p53可能是通過自身的高表達(dá)降低Bcl-2/Bax值抵抗低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，維持牦