基于Axin的活化復(fù)合體調(diào)節(jié)p53信號通路的分子機(jī)制.pdf

1、Daxx是一種重要的細(xì)胞死亡相關(guān)因子。近十年來的研究表明，Daxx通過其不同的功能結(jié)構(gòu)域與多種參與細(xì)胞生理生化過程的蛋白相互作用而形成多蛋白復(fù)合體。這些多樣的蛋白復(fù)合體，涉及了細(xì)胞增殖、生長與分化，細(xì)胞凋亡，轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及病毒復(fù)制等許多細(xì)胞復(fù)雜的生命活動(dòng)。盡管獲得了大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，但是，對Daxx在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的具體作用機(jī)理方面，至今仍存在一些爭議。其中，有關(guān)系統(tǒng)揭示Daxx如何通過p53信號途徑誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的課題亟待研究。故此，本論文采用

2、生物化學(xué)與分子生物學(xué)方法，系統(tǒng)闡明Daxx協(xié)同Axin/HIPK2/p53三聚復(fù)合體活化p53信號通路的分子機(jī)制及作用模型，從而強(qiáng)調(diào)出Daxx在促細(xì)胞凋亡方面的重要功能。本論文研究通過酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了Daxx與Axin之間的相互作用。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了內(nèi)源性的Daxx和Axin能在體內(nèi)直接結(jié)合。并且，二者之間的這種相互作用，在細(xì)胞接受UV刺激條件下會(huì)明顯增強(qiáng)。一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明Daxx不能直接結(jié)合p53，但是Axin作為“

3、橋梁”介導(dǎo)了Daxx與p53的結(jié)合。之后的研究證實(shí)了Daxx/Axin／p53復(fù)合體的作用，即盡管Daxx能夠單獨(dú)活化與HIPK2結(jié)合的p53，但Axin明顯加強(qiáng)了這一作用，說明Daxx／Axin／HIPK2／p53復(fù)合體的形成能夠?qū)е聀53活性的最大化，其功能相關(guān)性進(jìn)一步被RNA干擾實(shí)驗(yàn)證明。而且，Daxx調(diào)節(jié)的細(xì)胞生長抑制依賴于功能性的Axin與p53，因?yàn)樵诳寺“咝纬蓪?shí)驗(yàn)中，Daxx不能誘導(dǎo)Axin缺失細(xì)胞和p53缺失細(xì)胞的細(xì)胞死

4、亡。敲除Daxx或Axin嚴(yán)重削弱了UV或p53誘導(dǎo)的凋亡，與Daxx/Axin/HIPK2/p53復(fù)合體能夠誘導(dǎo)p53活性最大化的實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致。有趣的是，Daxx和Axin似乎選擇性地活化p53的靶向基因，強(qiáng)烈活化PUMA基因，而非p21和Bax基因。本論文還發(fā)現(xiàn)Daxx和Axin能夠誘導(dǎo)細(xì)胞色素c的釋放，這與兩種蛋白均能誘導(dǎo)PUMA基因活化相吻合。所有這些結(jié)果顯示出，Daxx能夠調(diào)節(jié)Axin／HIPK2／p53復(fù)合體誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，闡

5、明了Daxx調(diào)控腫瘤抑制子p53活化以及發(fā)揮促凋亡功能的新機(jī)理，也提示出Daxx在DNA嚴(yán)重?fù)p傷條件下誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的分子機(jī)制。 Pirh2是一個(gè)RING結(jié)構(gòu)域蛋白，先前已知它能夠與p53相互作用，并作為其E3連接酶負(fù)調(diào)節(jié)p53的穩(wěn)定性。在本論文研究中，我們通過酵母雙雜交篩選，已確定Pirh2作為一個(gè)新的Axin相互作用蛋白。目前證據(jù)顯示，Pirh2能夠通過破壞基于Axin的p53活化復(fù)合體的形成而抑制UV刺激響應(yīng)下的p53活化

6、。通過結(jié)合Axin，Pirh2促使HIPK2從Axin復(fù)合體上解離，抑制了HIPK2蛋白激酶對p53的作用。不過，我們在研究中用Mdm2作為陽性對照，未發(fā)現(xiàn)Pirh2對p53顯示出任何E3連接酶活性。當(dāng)與Pirh2共轉(zhuǎn)染時(shí)，p53的穩(wěn)定水平并沒有發(fā)生改變。并且，喪失E3活性的Pirh2突變體Pirh2 C145A未能削弱其對Axin或UV誘導(dǎo)下的p53第46位磷酸化的抑制功能。這些研究結(jié)果與先前的報(bào)道存在明顯差異。此外，我們發(fā)現(xiàn)siRN