2材料和方法新新

1、2 材料和方法 材料和方法2.1 實驗材料及處理 實驗材料及處理植物材料種植在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室內(nèi)，溫度為 25±4℃，光照強度約為800μmolm-2s-1，相對濕度 75%左右。以野生型番茄（Lycopersicon esculentum）品種“中蔬 4 號” ，T2 代（T1 代純合子）轉(zhuǎn)正、反義LeGPAT 基因番茄植株 T2-5(+)、T2-19(+)、和 T2-2(-)、T2-16(-) 為試材。種子浸種催芽 5d

2、生根后分別播于直徑 15cm、高 10 cm 的塑料盆中，蛭石作基質(zhì)，Hoagland 營養(yǎng)液培養(yǎng)，放置于溫室中生長。番茄生長至 8 片真葉時用于低溫逆境處理，于處理后選取最上部完全展開葉進行光合、熒光參數(shù)測定和 D1 蛋白修復(fù)的測定?；蛴谔幚砗笕∪~片，液氮冷凍，保存于-70℃用于活性氧產(chǎn)生、抗氧化酶活性等測定。492.2 轉(zhuǎn)基因番茄植株的 轉(zhuǎn)基因番茄植株的 PCR 檢測 檢測CTAB 法微量法提取基因組 DNA1、取 0.1-0.2

3、g 新鮮葉片，置液氮中研磨成粉，轉(zhuǎn)移到 1 .5 ml 離心管中，加入 1 ml 2×CTAB 提取緩沖液，輕輕攪動，使粉末充分散開，于65℃水浴中保溫 20 min。2、隨后，4℃，10000 rpm 離心 10 min。3、上清液轉(zhuǎn)入一新離心管中，加入 500μl 氯仿/異戊醇（24:1） ，輕輕混勻，放置 5 min。4、4℃，8 000 rpm 離心 10 min。5、將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中，加入 500μl 冷的異

4、丙醇，混勻，4℃放置 10 min。6、4℃，8 000 rpm 離心 10 min，去掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上。7、75%乙醇洗沉淀，置超凈工作臺中 20 min 吹干。8、加入 50μl TE 溶解 DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?×CTAB 提取緩沖液(100 ml)：取 1M Tris.Cl 10 ml；0.5 M EDTA 4ml；1)將研缽置于冰上預(yù)冷 10 min，在番茄葉片上打取 5 個葉園片放入研缽中，加

5、入 9 ml 氯仿:甲醇（1:2） ，將葉片研磨成勻槳；2)將勻槳轉(zhuǎn)移到 50 ml 大離心管中，于振蕩器上混勻后靜置 20 min；3)向離心管中加入 3 ml 氯仿和 5.4 ml 0.9M KCL，混勻后 1500 g 離心 15 min；離心的同時將硅膠板在點樣處做好標記并置于 105℃烘箱中活化 1 h；4)離心后吸取下層液入尖底玻璃管中并用 N2 吹干；5)將管底粉末用 0.2 ml 氯仿:甲醇（2:1）溶解、定容。、測定葉

6、綠素含量：參照 Bruinsma（1961）的方法。用進樣針取 10μl 樣品，加入 4.99 ml 80%丙酮混勻后，1000 g 離心 2 min，取上清液。然后以 80%丙酮為參比，使用 UV-160 型份光光度計測定樣品在 645 nm 和 663 nm 下的吸光值，并通過下面的公式計算葉綠素濃度：葉綠素濃度（mg/ml）＝((20.29*D645+8.05*D663)/1000)*500、脂類成分分析，即雙向薄層層析（TLC）

7、：參照 Xu 和 Siegenthaler（1997）的方法。1)按照葉綠素含量為 50μg 的量來上樣，將樣品點在硅膠板上左下角距左側(cè)和下側(cè)邊緣均為 1 cm 處，樣品要盡量點的均勻；2)點完樣后用吹風(fēng)機將硅膠板上的樣品吹干，放入第一向展層液中（丙酮:苯:水＝91:30:8）展層；當(dāng)展層液接近硅膠板的上邊緣時，將硅膠板取出，用吹風(fēng)機吹干，將硅膠板逆時針翻轉(zhuǎn) 90°置于第二向展層液（氯仿:甲醇:28%氨水＝13:7:1）中層析