圍生期十溴聯(lián)苯醚暴露上調小鼠睪丸雌激素受體α致血睪屏障破壞的研究.pdf

1、目的：十溴聯(lián)苯醚（decabromodiphenyl ether，BDE-209）作為一種重要的環(huán)境內分泌干擾物（environmental endocrine disruptors, EEDs）被廣泛用做阻燃劑添加于電器和生活用品中，是一種能夠干擾體內激素的合成、分泌、運輸、結合、作用、代謝的物質，具有神經、生殖、甲狀腺和免疫毒性。因有研究表明多溴聯(lián)苯醚的濃度與新生兒的體重呈負相關，減輕附睪重量，其表現(xiàn)出生命早期毒性作用，同時雌激素受

2、體(estrogen receptor，ER)有調控睪丸支持細胞增殖的作用，故為研究睪丸雌激素受體α(estrogen receptorα，ERα)在圍生期BDE-209暴露對F1雄性小鼠血睪屏障的破壞作用，使用ICR小鼠探討B(tài)DE-209對睪丸ERα、Formin1、F-actin,血睪屏障（blood-testis barrier，BTB）相關蛋白（claudin-11，occludin, ZO-1）表達以及BTB結構破壞的影響；此

3、外，使用BDE-209以及ERα的特異性抑制劑MPP（Methyl-Piperidino-Pyrazole）共同作用于SerW3細胞，檢測ERα, Formin1, F-actin和BTB相關蛋白表達水平影響，闡明BDE-209通過上調睪丸ERα致BTB破壞及其分子機制。
　　方法：
　　動物實驗中，取6周齡ICR雄鼠24只，雌鼠48只適應性飼養(yǎng)5天后，合籠取孕鼠，當天記為孕0天（GD0），按隨機數字表法將小鼠分到對照組（玉

4、米油100mg/kg BW組），BDE-209100 mg/kg BW組，BDE-209300mg/kg BW組，BDE-209500 mg/kg BW組。對妊娠（GD）7天后的F0母鼠進行經口灌胃BDE-209處理，每天清晨灌胃處理一次，連續(xù)灌胃至產后（PND）21天。每天清晨對F0孕鼠稱重，紀錄F0孕鼠致F1小鼠出生后21天F0孕鼠體重；記錄PND1 F1小鼠窩仔數，以及PND1至PND35 F1小鼠體重。于PND35和PND105

5、選取F1雄鼠，摘取小鼠眼球保留血樣，待取血結束后選擇頸椎脫臼處死，于冰浴上分離各臟器，將需制作組織形態(tài)學切片臟器按照相應條件儲存，其余臟器立即放于液氮罐中速凍儲存，并及時轉移致-80℃冰箱儲存，當需要對生物樣品進行檢測時取出，且禁止反復凍融。采用實時定量聚合酶鏈反應實驗法，免疫蛋白印跡法，免疫熒光化學發(fā)光法以及免疫組織化學法檢測小鼠睪丸ERα mRNA和蛋白表達改變，血睪屏障相關蛋白如 claudin-11，occludin，ZO-1m

6、RNA與蛋白表達改變，以及Formin1和F-actin蛋白改變，。
　　選擇SerW3細胞進行細胞實驗，采用MTT方法檢測24h不同濃度BDE-209（0μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml和150μg/ml）和MPP作用后的細胞生存率，確定 BDE-209染毒劑量。當復蘇或傳代細胞生長狀態(tài)穩(wěn)定后，待細胞覆蓋培養(yǎng)皿80%面積后加入 BDE-209與 MPP，此時細胞密度約為1×108，在BDE-209與M

7、PP作用細胞24h后觀察細胞形態(tài)學變化，免疫蛋白印跡法和免疫熒光方法檢測ERα，F(xiàn)ormin1, F-actin，血睪屏障相關蛋白(claudin-11，occludin，ZO-1)表達變化。
　　結果：
　　（1）圍生期BDE-209暴露致F1雄性小鼠體重與臟器系數改變：各BDE-209劑量組與對照組相比，不同時期體重均出現(xiàn)了不同程度下降（P<0.05）；F1雄性小鼠生殖系統(tǒng)的各臟器系數表現(xiàn)為：PND35時期，附睪的100

8、mg/kg BW組與對照組相比，臟器系數上升，且差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），PND105時期睪丸：各BDE-209組與對照組相比臟器系數下降，且差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；
　?。?）圍生期BDE-209暴露上調F1雄性小鼠睪丸ERαmRNA, ERα蛋白且MPP抑制BDE-209上調SerW3細胞ERα蛋白表達：與對照組相比，PND35時期的500mg/kg BW組的ERαmRNA表達上調（P<0.05）；而PND1

9、05時期F1小鼠的300mg/kg BW組，500mg/kg BW組的ERα表達上調（P<0.05）；通過免疫組織化學法觀察雄性F1小鼠睪丸組織中ERα的表達水平，PND35時期300mg/kg BW與500mg/kg BW組睪丸中ERα表達明顯增加；PND105時期500mg/kg BW組睪丸中ERα表達明顯增加；細胞實驗中SerW3細胞的BDE-209組的ERα蛋白的表達量明顯高于對照組（P<0.05）；
　?。?）圍生期BD

10、E-209暴露下調F1雄性小鼠睪丸Formin1且MPP抑制BDE-209下調SerW3細胞Formin1表達：PND35時期300mg/kg BW組，500mg/kg BW組與對照組相比，F(xiàn)ormin1表達下調（P<0.05）；而PND105時期小鼠的所有BDE-209組的Formin1的表達明顯低于對照組（P<0.05）；細胞實驗中SerW3細胞的BDE-209組的Formin1的表達明顯低于對照組（P<0.05）；
　?。?

11、）圍生期BDE-209暴露下調F1雄性小鼠睪丸F-actin且MPP抑制BDE-209下調SerW3細胞F-actin表達：PND35時期的F-actin的表達變化為300mg/kg BW組，500mg/kg BW組與對照組相比，表達下調（P<0.05），細胞實驗中 SerW3細胞的各個BDE-209組的F-actin的表達明顯低于對照組（P<0.05）；
　?。?）圍生期BDE-209暴露下調F1雄性小鼠睪丸BTB相關蛋白的mR

12、NA與蛋白表達且MPP抑制BDE-209下調SerW3細胞BTB相關蛋白表達： PND35與PND105兩個階段的claudin-11 mRNA：300mg/kg BW組，500mg/kg BW組表達明顯低于對照組（P<0.05），而ZO-1與occludin分子的mRNA的表達為只有PND35時期各BDE-209組的表達明顯低于對照組（P<0.05）； PND35時期的claudin-11：500mg/kg組相對于對照組表達下降（P<

13、0.05），而在PND105時期，300mg/kg BW組，500mg/kg BW劑量組表達低于對照組（P<0.05）；PND35與PND105時期ZO-1300mg/kg BW組，500mg/kg BW組表達量均顯著低于對照組（P<0.05）；occludin PND105時期BDE-209的300mg/kg BW組，500mg/kg BW組表達明顯低于對照組（P<0.05）;細胞實驗中BDE-209組的claudin-11，occl

14、udin的表達量與對照組相比，明顯較低（P<0.05），其余BDE-209組claudin-11, occludin的表達量相對于對照組差異無統(tǒng)計學意義,而ZO-1表達量在BDE-209組與對照組間無差異。
　?。?）圍生期BDE-209暴露致F1雄性小鼠組織形態(tài)學指標：HE切片發(fā)現(xiàn)兩個時期小鼠的睪丸組織的曲系精管出現(xiàn)不同程度損傷以及精子數目的改變，超微電鏡中各劑量組中緊密連接結構出現(xiàn)了不同程度的破壞，Sertoli細胞內細胞器也