圍生期十溴聯(lián)苯醚暴露上調(diào)小鼠睪丸雌激素受體α致血睪屏障破壞的研究.pdf

1、目的：十溴聯(lián)苯醚（decabromodiphenyl ether，BDE-209）作為一種重要的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物（environmental endocrine disruptors, EEDs）被廣泛用做阻燃劑添加于電器和生活用品中，是一種能夠干擾體內(nèi)激素的合成、分泌、運(yùn)輸、結(jié)合、作用、代謝的物質(zhì)，具有神經(jīng)、生殖、甲狀腺和免疫毒性。因有研究表明多溴聯(lián)苯醚的濃度與新生兒的體重呈負(fù)相關(guān)，減輕附睪重量，其表現(xiàn)出生命早期毒性作用，同時(shí)雌激素受

2、體(estrogen receptor，ER)有調(diào)控睪丸支持細(xì)胞增殖的作用，故為研究睪丸雌激素受體α(estrogen receptorα，ERα)在圍生期BDE-209暴露對(duì)F1雄性小鼠血睪屏障的破壞作用，使用ICR小鼠探討B(tài)DE-209對(duì)睪丸ERα、Formin1、F-actin,血睪屏障（blood-testis barrier，BTB）相關(guān)蛋白（claudin-11，occludin, ZO-1）表達(dá)以及BTB結(jié)構(gòu)破壞的影響；此

3、外，使用BDE-209以及ERα的特異性抑制劑MPP（Methyl-Piperidino-Pyrazole）共同作用于SerW3細(xì)胞，檢測ERα, Formin1, F-actin和BTB相關(guān)蛋白表達(dá)水平影響，闡明BDE-209通過上調(diào)睪丸ERα致BTB破壞及其分子機(jī)制。
　　方法：
　　動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，取6周齡ICR雄鼠24只，雌鼠48只適應(yīng)性飼養(yǎng)5天后，合籠取孕鼠，當(dāng)天記為孕0天（GD0），按隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分到對(duì)照組（玉

4、米油100mg/kg BW組），BDE-209100 mg/kg BW組，BDE-209300mg/kg BW組，BDE-209500 mg/kg BW組。對(duì)妊娠（GD）7天后的F0母鼠進(jìn)行經(jīng)口灌胃BDE-209處理，每天清晨灌胃處理一次，連續(xù)灌胃至產(chǎn)后（PND）21天。每天清晨對(duì)F0孕鼠稱重，紀(jì)錄F0孕鼠致F1小鼠出生后21天F0孕鼠體重；記錄PND1 F1小鼠窩仔數(shù)，以及PND1至PND35 F1小鼠體重。于PND35和PND105

5、選取F1雄鼠，摘取小鼠眼球保留血樣，待取血結(jié)束后選擇頸椎脫臼處死，于冰浴上分離各臟器，將需制作組織形態(tài)學(xué)切片臟器按照相應(yīng)條件儲(chǔ)存，其余臟器立即放于液氮罐中速凍儲(chǔ)存，并及時(shí)轉(zhuǎn)移致-80℃冰箱儲(chǔ)存，當(dāng)需要對(duì)生物樣品進(jìn)行檢測時(shí)取出，且禁止反復(fù)凍融。采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)實(shí)驗(yàn)法，免疫蛋白印跡法，免疫熒光化學(xué)發(fā)光法以及免疫組織化學(xué)法檢測小鼠睪丸ERα mRNA和蛋白表達(dá)改變，血睪屏障相關(guān)蛋白如 claudin-11，occludin，ZO-1m

6、RNA與蛋白表達(dá)改變，以及Formin1和F-actin蛋白改變，。
　　選擇SerW3細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，采用MTT方法檢測24h不同濃度BDE-209（0μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml和150μg/ml）和MPP作用后的細(xì)胞生存率，確定 BDE-209染毒劑量。當(dāng)復(fù)蘇或傳代細(xì)胞生長狀態(tài)穩(wěn)定后，待細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)皿80%面積后加入 BDE-209與 MPP，此時(shí)細(xì)胞密度約為1×108，在BDE-209與M

7、PP作用細(xì)胞24h后觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，免疫蛋白印跡法和免疫熒光方法檢測ERα，F(xiàn)ormin1, F-actin，血睪屏障相關(guān)蛋白(claudin-11，occludin，ZO-1)表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　?。?）圍生期BDE-209暴露致F1雄性小鼠體重與臟器系數(shù)改變：各BDE-209劑量組與對(duì)照組相比，不同時(shí)期體重均出現(xiàn)了不同程度下降（P<0.05）；F1雄性小鼠生殖系統(tǒng)的各臟器系數(shù)表現(xiàn)為：PND35時(shí)期，附睪的100

8、mg/kg BW組與對(duì)照組相比，臟器系數(shù)上升，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），PND105時(shí)期睪丸：各BDE-209組與對(duì)照組相比臟器系數(shù)下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；
　?。?）圍生期BDE-209暴露上調(diào)F1雄性小鼠睪丸ERαmRNA, ERα蛋白且MPP抑制BDE-209上調(diào)SerW3細(xì)胞ERα蛋白表達(dá)：與對(duì)照組相比，PND35時(shí)期的500mg/kg BW組的ERαmRNA表達(dá)上調(diào)（P<0.05）；而PND1

9、05時(shí)期F1小鼠的300mg/kg BW組，500mg/kg BW組的ERα表達(dá)上調(diào)（P<0.05）；通過免疫組織化學(xué)法觀察雄性F1小鼠睪丸組織中ERα的表達(dá)水平，PND35時(shí)期300mg/kg BW與500mg/kg BW組睪丸中ERα表達(dá)明顯增加；PND105時(shí)期500mg/kg BW組睪丸中ERα表達(dá)明顯增加；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中SerW3細(xì)胞的BDE-209組的ERα蛋白的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組（P<0.05）；
　?。?）圍生期BD

10、E-209暴露下調(diào)F1雄性小鼠睪丸Formin1且MPP抑制BDE-209下調(diào)SerW3細(xì)胞Formin1表達(dá)：PND35時(shí)期300mg/kg BW組，500mg/kg BW組與對(duì)照組相比，F(xiàn)ormin1表達(dá)下調(diào)（P<0.05）；而PND105時(shí)期小鼠的所有BDE-209組的Formin1的表達(dá)明顯低于對(duì)照組（P<0.05）；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中SerW3細(xì)胞的BDE-209組的Formin1的表達(dá)明顯低于對(duì)照組（P<0.05）；
　　（4

11、）圍生期BDE-209暴露下調(diào)F1雄性小鼠睪丸F-actin且MPP抑制BDE-209下調(diào)SerW3細(xì)胞F-actin表達(dá)：PND35時(shí)期的F-actin的表達(dá)變化為300mg/kg BW組，500mg/kg BW組與對(duì)照組相比，表達(dá)下調(diào)（P<0.05），細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中 SerW3細(xì)胞的各個(gè)BDE-209組的F-actin的表達(dá)明顯低于對(duì)照組（P<0.05）；
　　（5）圍生期BDE-209暴露下調(diào)F1雄性小鼠睪丸BTB相關(guān)蛋白的mR

12、NA與蛋白表達(dá)且MPP抑制BDE-209下調(diào)SerW3細(xì)胞BTB相關(guān)蛋白表達(dá)： PND35與PND105兩個(gè)階段的claudin-11 mRNA：300mg/kg BW組，500mg/kg BW組表達(dá)明顯低于對(duì)照組（P<0.05），而ZO-1與occludin分子的mRNA的表達(dá)為只有PND35時(shí)期各BDE-209組的表達(dá)明顯低于對(duì)照組（P<0.05）； PND35時(shí)期的claudin-11：500mg/kg組相對(duì)于對(duì)照組表達(dá)下降（P<

13、0.05），而在PND105時(shí)期，300mg/kg BW組，500mg/kg BW劑量組表達(dá)低于對(duì)照組（P<0.05）；PND35與PND105時(shí)期ZO-1300mg/kg BW組，500mg/kg BW組表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組（P<0.05）；occludin PND105時(shí)期BDE-209的300mg/kg BW組，500mg/kg BW組表達(dá)明顯低于對(duì)照組（P<0.05）;細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中BDE-209組的claudin-11，occl

14、udin的表達(dá)量與對(duì)照組相比，明顯較低（P<0.05），其余BDE-209組claudin-11, occludin的表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而ZO-1表達(dá)量在BDE-209組與對(duì)照組間無差異。
　　（6）圍生期BDE-209暴露致F1雄性小鼠組織形態(tài)學(xué)指標(biāo)：HE切片發(fā)現(xiàn)兩個(gè)時(shí)期小鼠的睪丸組織的曲系精管出現(xiàn)不同程度損傷以及精子數(shù)目的改變，超微電鏡中各劑量組中緊密連接結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了不同程度的破壞，Sertoli細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器也