大氣壓低溫等離子體失活金黃色葡萄球菌及其機(jī)理研究.pdf

1、大氣壓低溫等離子體因其氣體溫度低、化學(xué)活性強(qiáng)、無污染，適合直接應(yīng)用于熱敏感型基質(zhì)材料和人體組織等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中的多個(gè)領(lǐng)域。低溫等離子體在形成過程中可產(chǎn)生一系列活性基團(tuán)，近年來已開始應(yīng)用于生產(chǎn)生活與生物醫(yī)學(xué)中的滅菌消毒領(lǐng)域?？蒲泄ぷ髡咭验_發(fā)出多種低溫等離子體發(fā)生裝置并研究了其對(duì)各種類型微生物的滅活效果及相關(guān)機(jī)理。但迄今為止的研究主要集中在物理層面，即將細(xì)菌本身作為一個(gè)“黑盒”，通過改變各種等離子體特性參數(shù)從外部探究細(xì)菌的失活原

2、因，所得滅菌機(jī)制并不成熟。值得一提的是，從分子生物學(xué)層面尤其是微生物基因表達(dá)調(diào)控和質(zhì)粒結(jié)構(gòu)功能改變等角度進(jìn)行的等離子體滅菌機(jī)理研究較少，相關(guān)信息匱乏?；诖?，本論文一方面深入研究了大氣壓低溫等離子體對(duì)不同生存狀態(tài)下的金黃色葡萄球菌造成的失活效果和可能的作用機(jī)制，另一方面同時(shí)探索了等離子體處理使細(xì)菌在細(xì)胞和分子層面上可能發(fā)生的一系列結(jié)構(gòu)和功能改變，旨在為低溫等離子體滅菌技術(shù)和相關(guān)滅菌機(jī)理的完善提供幫助。
　　本文主要內(nèi)容包括以下幾個(gè)

3、方面:
　　1.適用于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的大氣壓低溫等離子體源的研制及其特性參數(shù)診斷
　　a)正弦交流驅(qū)動(dòng)的單電極惰性氣體等離子體射流裝置:交流高壓電源驅(qū)動(dòng)，一根很細(xì)的銅棒充當(dāng)高壓電極，可產(chǎn)生接近室溫(300 K)的等離子體射流，接觸人體皮膚表面時(shí)無灼熱感，放電產(chǎn)生的活性基團(tuán)可直接作用于靶點(diǎn)。
　　b)脈沖直流驅(qū)動(dòng)的大氣壓空氣中大面積多針放電等離子體裝置:該裝置以多根細(xì)銅棒作為電極陣列，通過限流電阻與高壓直流電源相連，可在電

4、極陣列與人體皮膚表面間形成大面積的接近室溫的等離子體(290-300 K)，安全可靠，對(duì)皮膚無損傷。
　　c)上述兩種低溫等離子體源的放電參數(shù)測(cè)量。
　　d)通過發(fā)射光譜法、質(zhì)譜法檢測(cè)了該等離子體射流中各種含氧/氮活性組分(RONS)的存在，并獲得等離子體射流中主要的代表性含氧/氮活性組分（包括多種中性粒子和正負(fù)離子等）在不同軸向位置的相對(duì)發(fā)射強(qiáng)度。其發(fā)射強(qiáng)度隨著檢測(cè)距離的改變發(fā)生變化，噴口下方5mm處上述活性組分的發(fā)射強(qiáng)度

5、基本上比10mm處要高。
　　e)通過發(fā)射光譜法檢測(cè)了該空氣放電等離子體中一系列含氧/氮活性組分的相對(duì)發(fā)射強(qiáng)度。通過光譜分析發(fā)現(xiàn)300-450 nm和600-800 nm處出現(xiàn)最強(qiáng)烈的發(fā)射峰，分別對(duì)應(yīng)于N2的第二正系(N2(C-B))和N2的第二正系的二次發(fā)射(second order emission)，同時(shí)檢測(cè)到200-300 nm處的NOγ系統(tǒng)的發(fā)射譜帶(NO(A-X))，以及777.2 nm和844.6 nm處的活性原子氧

6、(O)譜帶。
　　f)利用分光光度計(jì)檢測(cè)了不同劑量空氣放電等離子體處理后的細(xì)菌懸液中，代表性的長壽命活性組分H2O2，O3，NO2-，NO3-的濃度變化。
　　g)通過紫外吸收法檢測(cè)了該空氣放電等離子體產(chǎn)生臭氧的濃度(約507 ppm)。
　　2.大氣壓氦氣等離子體射流處理失活金黃色葡萄球菌生物膜的相關(guān)研究
　　采用不同劑量（時(shí)間）的大氣壓氦氣等離子體射流處理金黃色葡萄球菌生物膜。處理10 min后，生物膜中菌量

7、降低了3 log10以上，且微生物膜中細(xì)菌相較于貼壁的同類細(xì)菌對(duì)等離子體的抗性強(qiáng)。刃天青(Resazurin)檢測(cè)顯示大約70％的微生物膜中細(xì)菌失去新陳代謝能力，同時(shí)大約30％的細(xì)菌進(jìn)入一種存活但不能培養(yǎng)生長(VBNC)狀態(tài)。掃描電子顯微鏡(SEM)照片說明等離子體在處理微生物膜時(shí)首先侵蝕其細(xì)胞外多聚基質(zhì)(EPS)，然后攻擊細(xì)菌外部結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致微生物膜表面若干層細(xì)菌的結(jié)構(gòu)崩潰。SYTO9/PI染色的激光共聚焦顯微鏡(CLSM)照片說明

8、等離子體處理10 min后約69％的生物膜中細(xì)菌失去完整的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，基于細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性的等離子體作用深度約為12.4μm（5 min處理）;2，7-二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)染色的生物膜CLSM照片顯示了等離子體處理造成的與生物膜深度（層）相關(guān)的細(xì)菌內(nèi)活性含氧基團(tuán)(ROS)的積累，以ROS積累效果為標(biāo)識(shí)的等離子體作用深度約12.0μm。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明等離子體處理可能導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)ROS的生成，誘導(dǎo)菌內(nèi)氧化壓力上升，當(dāng)超過

9、細(xì)菌氧化應(yīng)激反應(yīng)閾值時(shí)造成細(xì)菌失活。
　　3.大氣壓空氣中多針放電等離子體處理對(duì)懸浮的金黃色葡萄球菌基因表達(dá)調(diào)控的影響
　　采用定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(q-rt-PCR)分析金黃色葡萄球菌在應(yīng)對(duì)不同劑量等離子體處理時(shí)，細(xì)菌中對(duì)抗環(huán)境壓力脅迫的相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平動(dòng)態(tài)表達(dá)調(diào)控。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明等離子體處理可能會(huì)影響細(xì)菌中與氧化應(yīng)激反應(yīng)，生物膜形成，抗生素抵抗和DNA損傷保護(hù)/修復(fù)相關(guān)的基因表達(dá)。等離子體放電產(chǎn)生的（氣相）以及誘導(dǎo)

10、細(xì)菌懸液中產(chǎn)生的（液相）含氧/氮活性組分可能是造成上述變化的主要原因。
　　4.大氣壓空氣中多針放電等離子體處理對(duì)懸浮的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌質(zhì)粒結(jié)構(gòu)的影響
　　等離子體處理金黃色葡萄球菌和大腸桿菌后，提取出質(zhì)粒進(jìn)行DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著等離子體處理劑量的增加，具超螺旋(super-coil)、開環(huán)(open-circle)和線狀(linear)結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒DNA濃度逐漸降低，說明細(xì)菌質(zhì)粒DNA結(jié)構(gòu)逐漸