RT-PCR檢測金黃色葡萄球菌活菌研究.pdf

1、目的:
　　 金黃色萄萄球茵(Staphylococcus aureus，SA)是人類和動物化膿性感染中最常見的病原菌，可引起食物中毒、化膿性感染、骨髓炎、毒素休克綜合征、肺炎和心內(nèi)膜炎等一系列不同程度的感染。一個不太嚴(yán)重的傷口感染也可由于該菌的存在發(fā)展為惡性的敗血癥、骨髓炎、膿毒性關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎等。近年來，隨著抗生素的大量使用，金黃色葡萄球菌耐藥菌株越來越多，其中，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resis

2、tant Staphylococcus aureus，MRSA)已經(jīng)在全世界范圍內(nèi)流行，據(jù)文獻報道，MRSA分離率已高達40％。因此，發(fā)展一種快速特異地檢測金黃色萄萄球茵的方法成為必要。
　　 目前，金黃色萄萄球茵的檢測方法多種多樣。細菌分離培養(yǎng)是最常規(guī)的方法，是微生物檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”，該法雖然可靠，但耗時、費力不能滿足快速檢測的需要；免疫學(xué)方法主要有免疫熒光法(IFA)、放射免疫法(RIA)和酶聯(lián)免疫法(ELISA)等。有文獻

3、指出，ELISA方法檢測腸毒素B的靈敏度為0.078μg/L，這些方法雖然具有一定特異性和敏感性，但通常需要結(jié)合細菌分離才能進行，也難滿足快速檢測需要；常規(guī)PCR法快速、特異、靈敏度很高，少至10cfu/ml的金黃色葡萄球菌也能被檢測出來，但由于死菌中的DNA降解較慢，不能區(qū)分死菌和活菌。然而，對于外傷性眼內(nèi)炎等某些感染性疾病來說，由于其感染部位比較特殊，明確標(biāo)本中的細菌死活可以為臨床提供更有針對性的治療，探討一種新的簡便、快速、靈敏、

4、特異并能區(qū)分細菌死活的檢測方法成為必要。目前，關(guān)于細菌性眼內(nèi)炎的報道中，革蘭陽性球菌占大多數(shù)，并呈現(xiàn)逐年上升趨勢。近期，在本實驗室接收的眼內(nèi)炎標(biāo)本中，同樣是革蘭氏陽性球菌居多數(shù)。
　　 因此，實驗選用金黃色葡萄球菌為目的菌，針對其mRNA利用RT-PCR方法進行檢測。目的在于探討RT-PCR檢測金黃色葡萄球菌區(qū)分死菌和活菌的有關(guān)問題，為臨床合理用藥提供依據(jù)，避免抗菌藥的濫用，減少耐藥菌株的出現(xiàn)。
　　 方法:
　　

5、 1．平板活菌計數(shù)法計數(shù)單菌落增菌后的金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC25923)及單個細菌增菌后活菌計數(shù)。
　　 2．平板活菌計數(shù)法計數(shù)替考拉寧和萬古霉素不同劑量下體外抗金黃色葡萄球菌殺菌曲線。
　　 3．藥敏紙片法及普通PCR方法檢測菌株是否為MRSA。
　　 4．普通PCR和RT-PCR比較篩選可用于RT-PCR的目的基因。
　　 5．RT-PCR檢測金黃色葡萄球的檢測限。
　　 6．RT-

6、PCR檢測金黃色葡萄球的特異性。
　　 7．RT-PCR檢測金黃色葡萄球活菌的時效。
　　 結(jié)果:
　　 1．耐藥菌株鑒定20株金黃色葡萄球菌臨床株中有12株細菌藥敏紙片結(jié)果為MRSA，占60％，其中mecA基因陽性的有9株細菌。
　　 2．殺菌曲線從殺菌曲線可以看出，替考拉寧(100μg/ml)、萬古霉素(100μg/mD作用10h后可將細菌殺死；替考拉寧(10μg/ml)作用12h后、萬古霉素(10μ

7、g/ml)作用14h后可將細菌殺死。
　　 3．引物確定在針對幾種目的基因設(shè)計的引物中，spa基因特異性較好，被用于后續(xù)RT-PCR實驗。
　　 4．靈敏度測定 RT-PCR檢測金黃色葡萄球的最小檢出量為1.0×104cfu/ml;單個細菌增菌6h后可以用RT-PCR方法檢測到目的條帶。
　　 5．特異性檢測所設(shè)計的引物序列對所選擇的金黃色葡萄球菌具有特異性，而對所選用的大腸埃希菌，銅綠假單胞菌，表皮葡萄球菌和化

8、膿性鏈球菌無特異性擴增。
　　 6．活菌檢測時效對于金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC25923)和MRSA活菌，RT-PCR均可以檢測出目的條帶；而對于滅活后的細菌，ATCC25923在高壓蒸汽滅活后2h不能用RT-PCR檢測到，MRSA在高壓蒸汽滅活后12h不能用RT-PCR檢測到。
　　 小結(jié):
　　 1．本文所設(shè)計的引物可用于RT-PCR方法檢測金黃色葡萄球菌活菌。
　　 2．RT-PCR方法在檢測敏