用雙重識(shí)別基團(tuán)分子印跡聚合物富集天然微量蛋白質(zhì)的研究.pdf

1、本文分為兩個(gè)部分：第一部分是用蛋白質(zhì)印跡聚合物分離富集天然微量蛋白質(zhì)的研究；第二部分是用nested PCR方法闡明編碼豬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)體中FKBP23的cDNA及克隆表達(dá)的研究。
　　 第一部分的研究工作是在本課題組蛋白質(zhì)印跡技術(shù)研究成果基礎(chǔ)上的進(jìn)一步發(fā)展。近年來，許多研究者開展了以蛋白質(zhì)為模板的分子印跡聚合物的研究，希望能夠以此作為分離純化蛋白質(zhì)的一種重要手段。在高等生命體中，絕大多數(shù)蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的含量是非常微小的，一般只占細(xì)胞液

2、中總蛋白量的萬分之幾或者更少，但是它們具有及其重要的生物學(xué)功能。分子克隆技術(shù)的建立和發(fā)展，使得人們可以用分子克隆的手段在大腸桿菌和酵母等低等生命體中表達(dá)高等生命體中的微量蛋白質(zhì)，通過低等生物的大量培養(yǎng)繁衍，得到較大的收獲量。盡管克隆蛋白質(zhì)和天然蛋白質(zhì)十分接近，但仍具有不同之處。高等生命體中的許多蛋白質(zhì)都含有修飾基團(tuán)，這些基團(tuán)都是在基因表達(dá)蛋白質(zhì)肽鏈合成后由專一的修飾體系完成的。而在低等生命體中不含有這些專一的修飾體系。這些結(jié)構(gòu)上的差異帶

3、來功能上的差別，有時(shí)是很大的。因此純化與鑒定這些天然的微量蛋白質(zhì)一直是科學(xué)家們非常感興趣的事情。在以前的研究工作中，我們?cè)谧R(shí)別體系中引入了限長(zhǎng)的輔助識(shí)別聚合物鏈，提高了對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)識(shí)別的專一性，取得了很好的富集效果。
　　 在本工作中，我們引入帶有雙重識(shí)別基團(tuán)的輔助識(shí)別聚合物鏈。在聚合物鏈上隨機(jī)分布有羧基和吡啶基團(tuán)作為識(shí)別基團(tuán)。以在大腸桿菌中克隆表達(dá)的豬親環(huán)素18蛋白質(zhì)作為模板。我們將輔助識(shí)別聚合物鏈與模板蛋白質(zhì)進(jìn)行自組裝，然后

4、將組裝體與作為第二單體的丙烯酰胺共同以聚乙烯醇接枝的大孔樹脂為固相載體在水相中進(jìn)行交聯(lián)聚合，洗脫掉模板蛋白質(zhì)后就得到了蛋白質(zhì)印跡聚合物。我們應(yīng)用該蛋白質(zhì)印跡聚合物對(duì)天然細(xì)胞提取物中的蛋白質(zhì)進(jìn)行吸附，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在吸附后的洗脫液中，目標(biāo)蛋白質(zhì)在總蛋白質(zhì)中的含量提高了200倍。在洗脫液中目標(biāo)蛋白質(zhì)的濃度達(dá)到了1.2μg/mL。這樣的濃度使我們可以對(duì)提取的天然豬親環(huán)素18進(jìn)行肽脯氨酰順反異構(gòu)酶活性(PPIase)的測(cè)定。我們發(fā)現(xiàn)提取的天然豬親環(huán)素

5、18的PPIase活性高于克隆的豬親環(huán)素18，并且天然的豬親環(huán)素18對(duì)外源配體免疫抑制劑環(huán)孢菌素A(CsA)的敏感性顯著高于克隆的蛋白質(zhì)。
　　 第二部分的研究工作是用nested PCR方法闡明編碼豬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)體中FKBP23的cDNA及克隆表達(dá)的研究。我們希望提高蛋白質(zhì)印跡聚合物的廣適性，并且進(jìn)一步研究純化的天然蛋白質(zhì)的性質(zhì)。我們選取豬FKBP23作為模板蛋白質(zhì)，因?yàn)镕KBP23是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)體中的一種糖蛋白，具有重要的生物學(xué)意義。

6、在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)體的選擇方面，我們選擇了豬肝中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)體。因?yàn)樨i肝容易獲得且廉價(jià)。因此需要克隆表達(dá)豬FKBP23為后續(xù)的工作奠定基礎(chǔ)。
　　 由于豬FKBP23的序列并未報(bào)道，我們根據(jù)已知物種的FKBP23序列的同源性分析，設(shè)計(jì)引物，PCR及序列分析，得到豬FKBP23的一段序列。再根據(jù)獲得的序列，應(yīng)用nested PCR的方法找尋FKBP23的5'及3'端序列，接拼得到632 bp cDNA序列。已申請(qǐng)NCBI的GenBank得到的序