長江流域棉紅鈴蟲鈣粘蛋白抗性等位基因的鑒定及分析.pdf

1、紅鈴蟲Pectinophora gassypiella是世界上最重要的棉花害蟲之一，曾經長時間在我國長江流域棉區(qū)造成嚴重危害。自該區(qū)域種植轉Bt基因棉花（以下簡稱Bt棉）以來，紅鈴蟲群得到了有效控制。然而，隨著Bt棉種植比例的不斷上升，已經檢測到該區(qū)域田間紅鈴蟲種群對Cry1Ac的敏感性下降。為了尋找有效抑制紅鈴蟲對Bt棉抗性發(fā)展的方法，本文從長江流域棉區(qū)采集紅鈴蟲田間個體，將其與室內抗性個體進行單對配對，從中篩選并純化出了多個紅鈴蟲C

2、ry1Ac抗性品系;通過分子生物學手段，明確了這些品系對Cry1Ac蛋白的抗性機理及其遺傳規(guī)律，建立了相應的抗性基因分子檢測方法。主要結果如下:
　　1)從田間篩選并純化了4個紅鈴蟲Cry1Ac抗性品系，分別為AQ65、AQ47、AQ189與JL88，這4個品系對Cry1Ac原毒素蛋白的抗性倍數分別為:304、220、254與289倍，并且均為常染色體偏隱性遺傳;其中AQ65、AQ47與AQ189品系對Cry2Ab有低水平的交互抗

3、性（分別為2.60、2.09與1.82倍），而JL88品系對Cry2Ab沒有交互抗性。
　　2)這4個抗性品系均是PgCad發(fā)生突變且該突變與Cry1Ac抗性完全連鎖。與敏感紅鈴蟲gCad相比，PgCad189與gCad88的基因組DNA分別插入了一個234 bp與3370 bp的片段，PgCad47缺失了一個314 bp的片段，而PgCad65則既缺失了549 bp又插入了198 bp。
　　3)針對4個抗性品系PgCad

4、的突變位點設計了8對特異性引物，用于檢測4種抗性等位基因及其基因型。2012-2015年長江流域紅鈴蟲的抗性基因頻率檢測結果表明:PgCad47、PgCad189與PgCad88在田間的平均頻率分別為0.0003、0.0002與0.0003，并且4年間沒有顯著性差異。
　　4)所有品系均能在常規(guī)棉棉鈴上完成生活史;4個抗性品系亦能在轉Cry1Ac棉棉鈴上完成生活史，但其存活率低于常規(guī)棉棉鈴并且發(fā)育歷期顯著延長、蛹重顯著降低;而敏感

5、品系則不能在轉Cry1Ac棉棉鈴上完成生活史。
　　5)將紅鈴蟲PgCad基因與GFP基因構建表達載體，在TnH5昆蟲細胞中表達融合蛋白并定位:表達敏感紅鈴蟲PgCad-GFP的TnH5細胞對Cry1Ac活化蛋白的半效應濃度(EC50)為6.79μg/ml，表達抗性紅鈴蟲鈣粘蛋白的TnH5細胞EC50均大于40μg/ml;敏感紅鈴蟲的PgCad-GFP主要定位在細胞膜上，而對于抗性紅鈴蟲，除了PgCad88A-GFP能定位到細胞膜

6、上外，PgCad47-GFP、PgCad65-GFP滯留在內質網上，PgCad189-GFP主要定位在囊泡上。
　　6)紅鈴蟲成蟲飼喂Cry1Ac實驗結果表明:與對照組相比，飼喂10、40與160μg/ml Cry1Ac蛋白的抗、感品系產卵期均顯著縮短、產卵量顯著下降，但成蟲壽命、產卵率、產卵前期與卵孵化率沒有差異。當蜂蜜水中的Cry1Ac蛋白提高到160與640μg/ml Cry1Ac時，與對照組相比，抗、感品系的成蟲壽命均顯著