谷氨酸脫羧酶重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建及其發(fā)酵優(yōu)化.pdf

1、目的：
　　利用微生物轉(zhuǎn)化來生產(chǎn)γ-氨基丁酸（Gama-aminobutyric，GABA）的過程中的關(guān)鍵酶為谷氨酸脫羧酶簡(jiǎn)稱（Glutamate decarboxylase，GAD）。目前對(duì)通過GAD催化法生產(chǎn)GABA的研究主要是在乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)和大腸桿菌(Escherichia coli)這兩種菌上，乳酸菌的催化轉(zhuǎn)化生產(chǎn)安全性非常高，但發(fā)酵過程比較困難，產(chǎn)量低，成本高。大腸桿菌催化生

2、產(chǎn)GABA研究也比較多，大腸催化產(chǎn)量高，成本低，但發(fā)酵過程容易產(chǎn)生內(nèi)毒素，有安全隱患。對(duì)枯草芽孢桿菌168(Bacillus subtilis)GAD轉(zhuǎn)化L-谷氨酸產(chǎn)GABA的研究很少?？莶菅挎邨U菌廣泛應(yīng)用在食品生產(chǎn)上，是通過美國(guó)食品藥物管理局(FDA)GRAS認(rèn)證的安全菌種。所以，要尋求枯草芽孢桿菌這種安全菌種高效的轉(zhuǎn)化生產(chǎn)GABA，為工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)提供基礎(chǔ)。
　　方法：
　　本文擴(kuò)增得到了編碼L-谷氨酸脫羧酶的基因gadB

3、，一般它來自于普通的大腸桿菌基因組,從而構(gòu)建了一株超表達(dá)GAD重組芽孢桿菌168/pHT01-gadB工程菌，在該重組菌的基礎(chǔ)上對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，搖瓶水平上利用通過單次單因子法確定了最佳碳源、最佳有機(jī)氮源和最佳無機(jī)氮源，再利用二水平正交試驗(yàn)，分析極差得到3個(gè)主要影響因子，最后通過Box-Behnken設(shè)計(jì)(BBD)與響應(yīng)面法(RSM)對(duì)3個(gè)因素的交互作用進(jìn)行研究，利用Design-Expert8.0.6軟件，以GAD酶為響應(yīng)值，進(jìn)行產(chǎn)

4、酶發(fā)酵優(yōu)化。通過上述方法組合得到的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基。
　　結(jié)論：
　　1.本文擴(kuò)增得到了編碼L-谷氨酸脫羧酶的基因gadB，它來自于大腸桿菌基因組,從而構(gòu)建了一株超表達(dá)GAD重組芽孢桿菌168/pHT01-gadB工程菌，超表達(dá)GAD基因工程菌的基礎(chǔ)。
　　2.搖瓶水平上首先通過單因素法確定了最佳碳源：蔗糖；最佳有機(jī)氮源：豆粕；最佳無機(jī)氮源：乙酸銨，得到改進(jìn)的培養(yǎng)基：蔗糖、豆粕、乙酸銨、七水硫酸鎂及磷酸二氫鉀等主要成分。

5、
　　3.再利用二水平正交試驗(yàn)，分析極差得到3個(gè)主要影響因子：蔗糖、磷酸二氫鉀及乙酸銨。
　　4.最后通過Box-Behnken設(shè)計(jì)(BBD)與響應(yīng)面法(RSM)對(duì)3個(gè)因素的交互作用進(jìn)行研究，利用Design-Expert8.0.6軟件，以GAD酶為響應(yīng)值，進(jìn)行產(chǎn)酶發(fā)酵優(yōu)化。通過上述方法組合得到的最佳培養(yǎng)基(g/L)為:蔗糖23.5,豆粕10、乙酸銨為8.5、磷酸二氫鉀4.1、七水硫酸鎂0.5，發(fā)酵pH=7.0，培養(yǎng)溫度37

6、度，搖瓶GAD酶活最高達(dá)到0.413U/mL，相比于優(yōu)化前的GAD酶活為0.143U/mL,酶活增加了約188.8％。
　　5.最優(yōu)培養(yǎng)基發(fā)酵得到工程菌，全細(xì)胞催化谷氨酸轉(zhuǎn)化生產(chǎn)GABA，發(fā)酵菌體轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，5L的發(fā)酵罐里面3%濕菌體，60g菌體，2L自來水，一共加入1189g谷氨酸后轉(zhuǎn)化48h，用量筒量轉(zhuǎn)化液為2.7L，最高產(chǎn)量達(dá)到239.91g/L，轉(zhuǎn)化谷氨酸的效率為54.48%。
　　6.通過發(fā)酵條件的優(yōu)化，使得發(fā)酵酶活