生物轉(zhuǎn)化法應(yīng)用重組谷氨酸脫羧酶合成γ-氨基丁酸.pdf

1、學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所提交的學(xué)位是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作和取得的研究成果。本論文中除引文外，所有實(shí)驗(yàn)、數(shù)據(jù)和有關(guān)材料均是真實(shí)的。本論文中除引文和致謝的內(nèi)容外，不包含其他人或其它機(jī)構(gòu)已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果。其他同志對(duì)本研究所做的貢獻(xiàn)均已在論文中作了聲明并表示了謝意。學(xué)位論文作者簽名：易籮遺日期：圳小叩學(xué)位論文使用授權(quán)聲明研究生在校攻讀學(xué)位期間論文工作的知識(shí)產(chǎn)權(quán)單位屬南京師范大學(xué)。學(xué)校有權(quán)保存本學(xué)位論文的電子和紙質(zhì)文

2、檔，可以借閱或上網(wǎng)公布本學(xué)位論文的部分或全部內(nèi)容，可以采用影印、復(fù)印等手段保存、匯編本學(xué)位論文。學(xué)?？梢韵驀矣嘘P(guān)機(jī)關(guān)或機(jī)構(gòu)送交論文的電子和紙質(zhì)文檔，允許論文被查閱和借閱。(保密論文在解密后遵守此規(guī)定)保密論文注釋：本學(xué)位論文屬于保密論文，保密期限為年。學(xué)位論文作者簽名：日期：指導(dǎo)教師彌參孫日期：洲夕≯7，’摘要摘要lIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIY1922032^r氨基丁酸“aminobutyricacid，GABA)是一

3、種以自由態(tài)形式存在的非蛋白質(zhì)組成氨基酸，是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制性傳遞物質(zhì)。GABA具有多種生理功能，如降血壓、預(yù)防癲癇、改善睡眠、抗抑郁、鎮(zhèn)靜安神、促進(jìn)激素分泌和保肝利腎等，其制備和應(yīng)用廣受人們的關(guān)注與重視。谷氨酸脫羧酶(glutamatedecarboxylase，GAD；EC41115)催化L一谷氨酸脫羧生成GABA，是生物催化谷氨酸脫羧生成GABA的限速酶。盡管大腸桿菌GAD和GABA合成已經(jīng)進(jìn)行了廣泛的研究，但如何獲取高活

4、性的重組GAD以及高效率、低成本、酶法生產(chǎn)具有多種應(yīng)用價(jià)值的GABA方法很少見報(bào)道。本研究的結(jié)果如下：l、以EcoliK12全基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，將擴(kuò)增出的gadA基因片斷和載體pET28a連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28agadA，將重組質(zhì)粒pET28agadA轉(zhuǎn)化至EcoliBL21中，構(gòu)建重組表達(dá)菌，用IPTG和乳糖對(duì)重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)，表達(dá)出大量分子量為53KDa左右的重組蛋白，而且重組蛋白占到全菌蛋白的70％75％左右，且

5、可溶性高。2、優(yōu)化了重組GAD粗酶液催化L谷氨酸鈉合成GABA的反應(yīng)條件。lmL反應(yīng)體系(含31g／L谷氨酸鈉，115U粗酶液，pH38)于37℃反應(yīng)4h，GABA的生成量達(dá)到1957g／L，L谷氨酸鈉的轉(zhuǎn)化率為93％，從而為GABA的小試生產(chǎn)提供了很好的前景。3、研究了大腸桿菌GAD的輔酶磷酸吡哆醛(PLP)及二價(jià)陽離子對(duì)其酶活的影響。研究表明：015mMPLP能使酶活提高約一倍，在pH38，06mMCa寸、75mMMn2對(duì)酶活有顯著

6、提高作用(相對(duì)酶活分別為174％，164％)，但兩者共效應(yīng)表現(xiàn)為拮抗效應(yīng)。Ca寸、M112的激活效應(yīng)明顯大于其它七種陽離子，激活效應(yīng)PLPCa：沖Mn2。推測(cè)EcoliGAD是一個(gè)PLPdependent，可能也是一種Ca2／CaM結(jié)合蛋白，能夠被PLP和Ca寸激活。1L放大反應(yīng)體系中，加入30mL粗GAD(12U／mL)，015mMPLP，O6mMCa2轉(zhuǎn)化150g底物谷氨酸(底物采取分批添加方式)，24h反應(yīng)轉(zhuǎn)化率達(dá)到90％以上，結(jié)