Streptococcus thermophilus TF96生長過程中胞內(nèi)代謝特征與氨基酸利用模式研究.pdf

1、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）作為發(fā)酵劑被廣泛的用于乳制品的生產(chǎn)。目前，嗜熱鏈球菌在乳品加工業(yè)中主要以直投式干粉發(fā)酵劑的形式被應用。直投式發(fā)酵劑制備的關鍵技術環(huán)節(jié)之一是乳酸菌的高密度培養(yǎng)，嗜熱鏈球菌在高密度培養(yǎng)過程中主要經(jīng)歷兩個方面的壓力因素，即不斷下降的胞內(nèi)pH和胞外逐漸增加的乳酸鈉濃度，這兩個壓力因素直接影響嗜熱鏈球菌的生長和高生物量的獲取。本論文主要研究了嗜熱鏈球菌在化學合成培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)時嗜

2、熱鏈球菌胞內(nèi)生理狀態(tài)的變化及氨基酸消耗模式和需求模式的變化，為后續(xù)的組學研究奠定基礎，并為嗜熱鏈球菌的高密度培養(yǎng)基的設計提供理論基礎。
　　本研究以Streptococcus thermophilus TF96為目標菌株，在化學合成培養(yǎng)基中對其進行增殖培養(yǎng)，分析了Streptococcus thermophilus TF96的生長動力學，在此基礎上利用現(xiàn)代分析技術研究了Streptococcus thermophilus TF96

3、在發(fā)酵過程中關鍵時間點上的胞內(nèi)pH和胞外乳酸鈉濃度的變化:利用試劑盒法和高效液相色譜技術分析了胞內(nèi)ATP、H+-ATP酶活性、NADH、NADPH和NH4+濃度的變化規(guī)律;利用氨基酸分析技術研究了Streptococcus thermophilusTF96在培養(yǎng)過程中氨基酸的消耗模式與需求模式。
　　Streptococcus thermophilus TF96于化學合成培養(yǎng)基中，在控制pH進行培養(yǎng)時，其胞內(nèi)pH逐漸降低，從對數(shù)生

4、長期初期(2.3h)的6.43降低至穩(wěn)定期(9h)的5.92;胞外乳酸鈉濃度逐漸升高，從對數(shù)生長期初期(2.3h)的89.45×10-4mol/L升高到穩(wěn)定期(9h)的199.77×10-4mol/L。Streptococcus thermophilus TF96在兩種壓力下生長，其胞內(nèi)生理學指標均發(fā)生變化。測得的Streptococcus thermophilus TF96胞內(nèi)ATP含量和H+-ATP酶活性隨胞內(nèi)H+濃度的增加而逐漸升

5、高，在2.3h時，ATP含量（12.08μmol/gprot）顯著高于其他時間點的ATP含量，在4.7～9h從2.20μmol/gprot升高到6.65μmol/gprot;在2.3h處的H+-ATP酶活性（0.67μmol/mgprot/hour）也顯著高于其他時間點的H+-ATP酶活性，在4.7～9h其活力從0.13μmol/mgprot/hour升高到0.40μmol/mgprot/hour;其胞內(nèi)NADH和NADPH的含量是隨著

6、胞內(nèi)H+濃度的增加而逐漸降低，在2.3h時，胞內(nèi)NADH含量較低，在4.7～9h時其含量從5.93nmol/107細胞降低到3.95nmol/107細胞;在2.3h處的胞內(nèi)NADPH含量也較低，在4.7～9h時其含量從2.07nmol/107細胞降低到1.07nmol/107細胞;其胞內(nèi)NH4+的含量逐漸升高，在4.7～9h時其含量從16.74 mg/L升高到36.78 mg/L。實驗結果表明Streptococcus thermoph

7、ilusTF96為了適應在不斷降低的胞內(nèi)pH和逐漸增加的乳酸鈉濃度下生長，Streptococcusthermophilus TF96對胞內(nèi)的生理學狀態(tài)作出了相應的調(diào)節(jié)以保持其生長狀態(tài)。
　　Streptococcus thermophilus TF96氨基酸消耗模式隨生長率變化的研究結果表明，在整個生長過程中，氨基酸消耗量最大的是Asx（天冬氨酸和天冬酰胺）、Glx（谷氨酸和谷氨酰胺）、絲氨酸和精氨酸，其中Asx（天冬氨酸和天冬

8、酰胺）、Glx（谷氨酸和谷氨酰胺）和絲氨酸分別占氨基酸消耗總量的17.15％、18.73％和13.37％，而精氨酸的消耗量占培養(yǎng)基中精氨酸添加量的98％;其次，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和賴氨酸的消耗量占氨基酸消耗總量的3％～10％，而剩余氨基酸（甘氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、組氨酸和脯氨酸）消耗量較低。在平均生長率為μ1=0.12h-1時，細胞處于調(diào)整階段，所以所有氨基酸消耗量均顯著高于其他時間點的氨基酸消耗量，而

9、在平均生長率為μ2=0.36h-1，μ3=0.52h-1，μ4=0.08h-1時，氨基酸的消耗量隨μ的增加而增加。試驗結果表明Streptococcus thermophilusTF96為了適應在不斷降低的胞內(nèi)pH和逐漸增加的乳酸鈉濃度下生長，調(diào)整菌體氨基酸的消耗量來使菌體更好的生長。
　　Streptococcus thermophilus TF96氨基酸需求模式隨生長率的變化結果表明，隨著μ的增加，氨基酸的需求量發(fā)生顯著變化，

10、需求量最大的氨基酸有Asx（天冬氨酸和天冬酰胺）、Glx（谷氨酸和谷氨酰胺）和賴氨酸，其需求量分別占氨基酸需求總量的14.41％，15.64％和10.37％;其次，蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸和亮氨酸的需求量占需求總量的4％～8％，而剩余氨基酸（纈氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸和精氨酸）需求量較低。當平均生長從μ1=0.12h-1到μ2=0.36h-1時，氨基酸需求量顯著增加，當平均生長率從μ3=0.52h-1到μ

11、4=0.08h-1時，氨基酸需求量也顯著增加。試驗結果表明Streptococcusthermophilus TF96受到雙重壓力下，氨基酸合成各種應急蛋白來調(diào)節(jié)菌體狀態(tài)。
　　在Streptococcus thermophilus TF96培養(yǎng)過程中，氨基酸消耗總量為37.31mmol/gdw，其生物需求量為13.24mmol/gdw，氨基酸的消耗量明顯高于其生物合成需求量，約2.8倍，這說明菌體生長過程中消耗掉培養(yǎng)基中的氨基酸