耐甲氧西林金黃色葡萄球菌mecA基因檢測的電化學生物傳感方法研究.pdf

1、目的：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）是全球人類細菌感染的主要病原體。臨床數(shù)據(jù)表明，MRSA感染的快速診斷和早期治療對控制感染有積極影響。MRSA對甲氧西林的耐藥機制主要是由青霉素結合蛋白（PBP2a）介導的，而這種結合蛋白的編碼基因是葡萄球菌染色體mec（SCCmec）中的mecA基因，所以通過檢測mecA基因中的一段特異性序列就可以快速直接評估金黃色葡萄球菌對甲氧西林的耐藥性。本研究分別利用循環(huán)放大技術和級聯(lián)識別策略制備兩種電化

2、學生物傳感器，從基因水平對MRSA感染進行靈敏特異的檢測，從而促進細菌感染的早期診斷。
　　方法：⑴兩種電化學生物傳感器的制備：基于等溫鏈置換聚合酶反應（ISDPR）和底物循環(huán)放大策略構建超靈敏的電化學DNA傳感器；基于級聯(lián)DNA分支遷移技術和雙信號識別系統(tǒng)構建高特異的電化學DNA傳感器。用電化學阻抗譜法（EIS）、循環(huán)伏安法（CV）、原子力顯微鏡（AFM）、熒光分光光度法、瓊脂糖凝膠電泳等方法對傳感器每一步的修飾進行表征。⑵分析

3、電化學DNA傳感器的可行性并優(yōu)化其重要實驗條件：如探針的固定順序、比例、時間、溫度和濃度，聚合酶的濃度和反應溫度等。⑶傳感器性能考察及樣本檢測：考察兩種傳感器的分析性能，如檢測線性范圍、最低檢測限、特異性、重復性和穩(wěn)定性等。利用簡單的信號轉導機制輸出電化學信號，用方波伏安法（SWV）檢測電化學信號。
　　結果：①用不同的方法對兩種電化學生物傳感器的制備過程進行表征，不同方法共同驗證電極的成功修飾和制備。②基于ISDPR技術的電化學

4、生物傳感器各項性能：可靈敏地檢測mecA基因；線性范圍為0.075-200 pM；最低檢測限為63 pM；重復性和穩(wěn)定性良好。③基于級聯(lián)DNA分支遷移技術的電化學生物傳感器各項性能：本檢測方法展現(xiàn)了良好的分析性能；最低檢測限是85 pM；具有高的單堿基突變識別能力。
　　結論：分別采用目標物循環(huán)放大策略和自發(fā)性的DNA分支遷移技術構建兩種新穎電化學生物傳感器來檢測MRSA中的mecA基因。在ISDPR的信號放大作用下，顯著地提高了