正二十八烷醇抗炎作用的機理研究.pdf

1、二十八烷醇(n-octacosanol)是一種具有眾多生理功能的一元高級飽和直鏈脂肪醇(CH3(CH2)26CH20H)，主要以蠟酯形式存在于米糠、甘蔗等天然植物中。由于我國稻谷產(chǎn)量豐富，因此研究從米糠中提取的活性成分二十八烷醇的生理功能及分子機制，對稻谷和其副產(chǎn)物的開發(fā)利用具有重要的實際與經(jīng)濟意義。二十八烷醇化學性質(zhì)穩(wěn)定且?guī)缀鯚o毒性。研究表明二十八烷醇具有促進新陳代謝，抗疲勞，保護心血管等多種生理功能。近年研究發(fā)現(xiàn)二十八烷醇還表現(xiàn)出抗

2、炎活性，其抗炎功能分子機制尚不明確。本文利用脂多糖(LPS)誘導RAW264.7細胞炎癥模型，以及葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導小鼠潰瘍性結(jié)腸炎癥模型，來探究二十八烷醇抗炎功效及其分子機理。二十八烷醇對結(jié)腸炎癥小鼠宏觀表型、組織損傷的影響。本文利用3.0％ DSS水溶液，ICR小鼠連續(xù)自由飲用11d，建立結(jié)腸炎癥模型。飲用DSS水溶液之前，保護組小鼠提前2天灌胃二十八烷醇混懸液（100 mg/kg/day）。DSS損傷組小鼠出現(xiàn)體重下降、懶

3、動、嗜睡、毛發(fā)光澤度下降及肉眼可見便血等現(xiàn)象，疾病活動指數(shù)（DAI）不斷升高。其結(jié)腸組織發(fā)生潰瘍、充血、水腫等癥狀，腸壁增厚，長度縮短，重量增加、脾臟增大。保護組小鼠精神狀態(tài)有所改善，肉眼可見少量便血或無便血，DAI評分顯著降低。結(jié)直腸發(fā)生潰瘍、水腫程度減輕，腸壁增厚，腸重增大、長度萎縮較損傷組有所減少。制作HE染色結(jié)腸組織切片，顯微鏡下可觀察到:與正常組相比，損傷組小鼠結(jié)腸呈現(xiàn)出顯著的急性炎癥反應癥狀:黏膜大面積糜爛、潰瘍，腺體的隱窩

4、結(jié)構(gòu)被破壞，淋巴細胞及伴中性粒細胞等炎性細胞浸潤，杯狀細胞丟失;保護組小鼠只有少量出血、炎性細胞浸潤，黏膜和隱窩結(jié)構(gòu)相對完整，排列比較整齊。
　　二十八烷醇對結(jié)腸炎癥小鼠生化指標含量的影響。利用試劑盒，檢測小鼠結(jié)腸組織中MPO、MDA和炎癥介質(zhì)NO的含量。測得損傷組小鼠結(jié)腸組織中MPO、MDA和NO含量分別升高為對照組的2.9倍、3.1倍與3.8倍，差異顯著;與損傷組對比，二十八烷醇保護組小鼠結(jié)腸組織中MPO、MDA和NO含量分別

5、降低為其0.65、0.59和0.65倍，差異顯著。
　　二十八烷醇對結(jié)腸炎癥小鼠炎癥因子表達的影響。分別利用實時熒光定量real-time PCR和Western blot技術檢測結(jié)腸組織腫瘤壞死因子-α(TNF-α）、白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的表達量。與對照組相比，損傷組小鼠結(jié)腸組織中四種炎癥因子mRNA表達量分別升高7.51、6.16、12.95和16.54倍，

6、差異顯著;而與損傷組比較，二十八烷醇組小鼠中四種mRNA表達量分別降低為其0.61、0.45、0.25和0.61倍，差異顯著。損傷組小鼠結(jié)腸組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS的蛋白表達量分別升高為對照組的4.44、2.73、4.54和5.00倍。而二十八烷醇保護組四種蛋白分別降低為損傷組的0.75、0.63、0.78和0.80倍，差異顯著。二十八烷醇可使小鼠結(jié)腸組織中炎癥因子表達量顯著減少。
　　本實驗利用1

7、.0μg/mL LPS溶液誘導RAW264.7細胞炎癥模型，設置對照，LPS誘導，LPS+10μg/mL、30μg/mL和100μg/mL二十八烷醇干預組五組細胞。二十八烷醇對LPS誘導RAW264.7細胞毒性影響。將細胞置于光學顯微鏡下觀察，各組細胞數(shù)量排列密集，形狀呈梭狀，生長狀態(tài)良好，細胞狀態(tài)無明顯差異。采用MTS法檢測二十八烷醇對RAW264.7細胞毒性的影響。對照組、二十八烷醇組OD值之間無顯著差異(p＞0.05)。說明10～

8、100μg/mL二十八烷醇溶液對RAW264.7細胞無毒性，對其生長、狀態(tài)及活性無影響，可用于后續(xù)實驗研究。二十八烷醇對LPS誘導RAW264.7細胞炎癥因子表達的影響。分別采用RT-qPCR和Western blot比較各組細胞炎癥基因表達差異。LPS組細胞TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS炎癥因子mRNA表達量升高為對照組的5.66、7.59、6.78和2.62倍;與LPS組細胞表達量比較，10μg/mL、30μg/mL和1

9、00μg/mL三組二十八烷醇保護組細胞中四種炎癥因子mRNA表達量均顯著降低，且呈劑量依賴性。LPS誘導組細胞中TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS炎癥因子蛋白表達量分別為對照組細胞的4.31、4.80、6.25和4.29倍。與LPS組細胞比較，三組二十八烷醇保護組細胞中四種蛋白表達量顯著降低，且呈劑量依賴性。二十八烷醇可顯著降低細胞中炎癥因子的表達水平。
　　二十八烷醇對LPS誘導RAW264.7細胞中核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κ

10、B/p65)和(AP-1/c-Jun)轉(zhuǎn)錄活性的影響。分別利用熒光素酶報告基因和Western blot技術，研究轉(zhuǎn)錄因子活性和其核移位作用。與對照組相比，LPS誘導組細胞AP-1與NF-κB相對熒光素酶活性(RLU)顯著升高，分別為對照組細胞RLU3.41和2.49倍;而二十八烷醇組細胞中RLU值顯著減少，呈劑量依賴性。LPS組細胞細胞核中c-Jun和p65蛋白表達量分別增加2.17、1.56倍;而細胞漿中c-Jun和p65蛋白表達量

11、分別為其0.53、0.41倍。與LPS組細胞比較，二十八烷醇組細胞中，細胞核c-Jun和p65蛋白表達量顯著降低，細胞漿中兩種蛋白表達量明顯升高，且呈劑量依賴性。因此，二十八烷醇可顯著抑制炎癥細胞p65與c-Jun的核移位作用，降低AP-1、NF-κB轉(zhuǎn)錄活性。
　　二十八烷醇對RAW264.7細胞中絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路關鍵靶分子的磷酸化作用:LPS誘導組細胞中p38、c-Jun氨基末端激酶（JNK）與細胞外調(diào)節(jié)蛋白

12、激酶1/2(ERK1/2)磷酸化作用顯著升高，分別為對照組細胞3.80、2.23和2.56倍。與LPS組細胞比較，二十八烷醇組三組細胞中p38、JNK磷酸化水平顯著減少，且呈劑量依賴性。100μg/mL二十八烷醇組細胞p-ERK1/2表達顯著減少。說明LPS可促進RAW264.7細胞中p38、ERK和JNK磷酸化，而二十八烷醇可顯著抑制其磷酸化的激活。
　　使用MAPK抑制劑處理RAW264.7細胞，利用Western blot及

13、熒光素酶報告基因技術分析了各組細胞中炎癥因子TNF-α、IL-1β表達量，p38、JNK及ERK1/2的磷酸化水平，以及其對轉(zhuǎn)錄因子活性的影響。結(jié)果顯示，與LPS誘導組相比，抑制劑組細胞中TNF-α、IL-1β表達量，以及p38、JNK及ERK1/2磷酸化蛋白表達水平顯著減少，AP-1、NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的活性降低。在二十八烷醇與抑制劑共同作用下，炎癥因子含量、MAPK磷酸化水平與轉(zhuǎn)錄因子活性進一步降低。說明MAPK磷酸化作用可使轉(zhuǎn)錄因

14、子活性增強，炎癥因子表達增多。二十八烷醇通過阻斷MAPK通路，發(fā)揮抗炎功效。
　　綜上，在動物整體水平，二十八烷醇能夠顯著改善DSS誘導結(jié)腸炎癥小鼠宏觀表型，降低DAI，減輕結(jié)腸組織病理損傷;減少結(jié)腸組織中MPO、MDA和NO含量;抑制結(jié)腸組織炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS基因的過表達。細胞水平，二十八烷醇可下調(diào)LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS基因的過表達;抑制