核酸生物傳感器在臨床檢驗診斷中的應用探索.pdf

1、核酸生物傳感器是20世紀90年代中期逐漸發(fā)展起來的一種新的傳感器技術。核酸傳感器以DNA作為敏感元件，通過換能器將DNA與待測物質之間相互作用的生物信號轉變?yōu)榭蓽y的信號。與傳統(tǒng)方法相比，DNA生物傳感器具有快速、靈敏、操作簡單、特異性強、適合于POCT檢測等特點。根據換能器的不同，DNA傳感器可以分為電化學，熒光，石英晶體微天平和場效應晶體管DNA傳感器。近年來DNA傳感器在基因診斷，環(huán)境監(jiān)控，藥物研究等領域的應用受到廣泛重視。本文運用

2、電化學生物傳感器進行了Dam轉甲基酶的檢測，并嘗試對核酸自主裝進行機制闡釋；運用熒光分析法建立了對人工合成短鏈核酸實現(xiàn)特異性檢測的熒光傳感器。
　　本研究主要內容包括：⑴基于鄰位連接反應和金納米顆粒協(xié)同放大作用的生物傳感器檢測甲基轉移酶活性。闡述了一種基于insertion法、甲基化抵抗酶切作用、金納米顆粒富集作用和鄰位雜交反應的turn-on電化學生物傳感器用來檢測甲基轉移酶引起的DNA腺嘌呤甲基化。包含Dam甲基轉移酶和Mbo

3、 I酶切位點的雙鏈DNA首先通過金-硫配位鍵固定于金電極表面。緊接著分別用Dam甲基轉移酶和Mbo I限制性內切酶進行處理，試驗結果顯示經過上述處理后電極上存在甲基化的dsDNA和12nt的殘留核苷酸。由于鏈霉親和素-生物素之間的高親和作用使得信號探針與殘留核苷酸雜交，金納米顆粒的富集作用使得大量的信號分子靠近金電極表面。在最優(yōu)反應條件下，DPV信號與Dam轉甲基酶在0.1-40UmL1線性相關，其動態(tài)范圍為0.05-50UmL1，最低

4、檢測限為0.024UUmL1（S/N=3規(guī)則）。傳感器展現(xiàn)了良好的穩(wěn)定性、特異度和抗干擾能力，該傳感器在核酸分析和轉甲基酶加測等方面具有廣泛的應用價值。⑵Insertion法在金電極表面固定探針以提高探針雜交效率的試驗研究。電化學核酸傳感器的分析性能與傳感器表面核酸探針的組裝密切相關。通過兩步backfilling法固定巰基化的核酸探針和MCH是制作核酸傳感界面的最常用方法。在本節(jié)中，我們展現(xiàn)出了通過insertion法在已有MCH層插

5、入巰基化DNA從而獲得傳感器識別界面的新方法。運用計時電量法來表征backfilling法和insertion法捕獲探針的密度和雜交效率。我們發(fā)現(xiàn)通過insertion方法獲得的傳感界面優(yōu)于backfilling法。為了進一步闡述其反應機制，我們分別從動力學和熱力學兩反面進行了闡述。⑶基于鏈置換級聯(lián)反應實現(xiàn)核酸的特異性檢測。闡述了一種基于級聯(lián)核酸鏈置換反應以在常溫下實現(xiàn)核酸特異性檢測的方法。級聯(lián)鏈置換反應由toehold介導的鏈置換反應