多肽-金屬納米簇的制備及其用于生物分析檢測(cè)研究.pdf

1、貴金屬納米簇以其具有光致發(fā)光、生物相容性等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于生物檢測(cè)分析領(lǐng)域。然而，金屬納米簇的制備過程中大多需要外加還原劑，而還原劑的加入將影響模板的生物功能。并且在金屬納米簇的生物檢測(cè)應(yīng)用中，多數(shù)檢測(cè)方法涉及偶聯(lián)和標(biāo)記的過程，步驟復(fù)雜不易操作。因此，發(fā)展一種無需還原劑且操作簡(jiǎn)單的金屬納米簇制備方法對(duì)其在生物檢測(cè)方面的應(yīng)用有重要意義。蛋白激酶作為生命體內(nèi)重要的激酶，其活性和濃度與很多重大疾病和癌癥緊密關(guān)聯(lián)，因此建立高靈敏且操作簡(jiǎn)單的蛋

2、白激酶檢測(cè)方法，不僅可以提供癌癥早期的篩查，還有助于其他磷酸化相關(guān)癌癥的發(fā)現(xiàn)和抗癌新藥的篩選。本論文致力于研究以多肽-金屬納米簇為熒光探針，設(shè)計(jì)一系列綠色、免標(biāo)記、操作簡(jiǎn)單且靈敏的檢測(cè)蛋白激酶新方法，為磷酸化相關(guān)疾病的早期診斷及抗癌藥物的篩選提供幫助。主要研究?jī)?nèi)容如下：
　　1、以多肽-金納米簇（peptide-Au NCs）為熒光探針，基于Zr4+能夠誘導(dǎo)磷酸化的peptide-Au NCs發(fā)生團(tuán)聚的原理，構(gòu)建了一種無需標(biāo)記、靈

3、敏度高、操作簡(jiǎn)單的檢測(cè)蛋白激酶CK2的方法。其中，以多肽為模板，通過多肽中的酪氨酸將Au3+還原成Au NCs，并且通過半胱氨酸捕獲Au NCs，從而合成熒光peptide-AuNCs。這種在沒有任何外加還原劑條件下制備peptide-Au NCs的方法既實(shí)現(xiàn)原位簡(jiǎn)單的制備多肽功能化的Au NCs，又使多肽免受還原劑的破壞，保持了多肽的生物活性，有益于peptide-Au NCs的進(jìn)一步生物應(yīng)用。在構(gòu)建生物模板化的納米材料時(shí)，利用一步制

4、備peptide-Au NCs法，同時(shí)達(dá)到模板化的效果，避免了一般生物模板化的方法所必須的標(biāo)記及偶聯(lián)過程，以其為探針檢測(cè)蛋白激酶CK2，其濃度與peptide-Au NCs熒光猝滅率成良好的線性關(guān)系，線性范圍在0.08-2U/mL，檢測(cè)限為0.027U/mL。通過對(duì)蛋白激酶CK2的抑制劑鞣花酸、DRB、大黃素和槲皮素在人體血清樣品中的評(píng)估證明我們?cè)O(shè)計(jì)的這種peptide-Au NCs生物傳感器可實(shí)現(xiàn)在復(fù)雜生物樣品中對(duì)抑制劑的檢測(cè)及篩選。

5、正如預(yù)期，測(cè)得鞣花酸的IC50值（半抑制濃度）為0.045μmol/L。此生物傳感同樣可以檢測(cè)更多的蛋白激酶，只需在相應(yīng)蛋白激酶的底物多肽氨基端加入CCY多肽序列即可。我們?cè)O(shè)計(jì)的這種peptide-Au NCs構(gòu)建的檢測(cè)蛋白激酶的生物傳感，由于其綠色、溫和、通用、操作簡(jiǎn)單及免標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)，在蛋白激酶相關(guān)的生物化學(xué)基本研究及抑制劑的篩選領(lǐng)域提供了潛在應(yīng)用。
　　2、利用多肽-銀納米簇（peptide-Ag NCs）較好的熒光性質(zhì)，并以

6、其為輸出信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)磷酸化程度的檢測(cè)（即蛋白激酶的活性）。在蛋白激酶CK2的催化下，多肽發(fā)生磷酸化作用。由于多肽的磷酸化作用能阻止羧肽酶Y對(duì)多肽的水解，因此在加入羧肽酶Y后，多肽不會(huì)發(fā)生水解。再利用一步多肽制備法，在不外加入任何還原劑的條件下制備了以多肽為模板及保護(hù)劑的peptide-Ag NCs。然而，在沒有蛋白激酶CK2的情況下，羧肽酶Y將多肽水解成游離的氨基酸殘基，不能制備peptide-Ag NCs。通過兩者熒光強(qiáng)度的差異

7、，實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)磷酸化程度的免標(biāo)記檢測(cè)。此方法雖能實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白激酶的檢測(cè)，但在制備peptide-Ag NCs過程中，外界因素（如溫度控制、攪拌速率等）對(duì)制備的peptide-Ag NCs熒光強(qiáng)度有影響，從而可能影響到檢測(cè)結(jié)果，并且與合成的peptide-Au NCs相比，peptide-Ag NCs的熒光發(fā)射強(qiáng)度較低，因此，還需進(jìn)一步試驗(yàn)改進(jìn)。
　　3、基于上述實(shí)驗(yàn)的不足，我們對(duì)蛋白激酶檢測(cè)方法進(jìn)行了改進(jìn)。利用peptide-Au

8、NCs為熒光探針，基于羧肽酶Y對(duì)peptide-Au NCs的猝滅作用，構(gòu)建了一種新穎且靈敏的蛋白激酶PKA熒光“turn on”檢測(cè)方法。其中，使用一種綠色的一步多肽生物礦化法成功制備了peptide-Au NCs。peptide-Au NCs被羧肽酶Y水解導(dǎo)致其熒光發(fā)生猝滅。然而，在蛋白激酶PKA的催化作用下peptide-Au NCs發(fā)生磷酸化，保護(hù)peptide-Au NCs的熒光不被猝滅。基于兩者熒光強(qiáng)度的差別，實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白激酶

9、PKA活性高靈敏的檢測(cè)。通過對(duì)蛋白激酶PKA的抑制劑鞣花酸在人體血清樣品中的評(píng)估，證明此檢測(cè)蛋白激酶的方法可實(shí)現(xiàn)在復(fù)雜生物樣品中對(duì)抑制劑的檢測(cè)。據(jù)此，我們發(fā)展的蛋白激酶熒光“turn on”檢測(cè)方法避免了多數(shù)蛋白激酶檢測(cè)方法中涉及到的偶聯(lián)和標(biāo)記過程，避免“假陽(yáng)性”信號(hào)的產(chǎn)生，提高了其抗干擾能力，以其操作簡(jiǎn)單及無需標(biāo)記等特點(diǎn)，在實(shí)際生物領(lǐng)域中對(duì)磷酸化相關(guān)疾病的發(fā)現(xiàn)與早期診斷可能具有潛在應(yīng)用。
　　4、利用peptide-Au NCs

10、和CdSe/ZnS QDs@SiO2作為雙發(fā)射的比率熒光探針（CdSe/ZnS QDs@SiO2@Au NCs），構(gòu)建一種新穎、可視化且靈敏的比率熒光檢測(cè)蛋白激酶PKA的方法。以多肽作為模板制備peptide-Au NCs的過程無需額外加入還原劑，避免多肽受到還原劑的破壞。此比率熒光探針對(duì)蛋白激酶PKA的檢測(cè)范圍在0.01U/mL-40U/mL，檢測(cè)限為0.004U/mL。通過對(duì)人體血清中蛋白激酶PKA抑制劑的檢測(cè)和篩選，證明此比率熒光

11、探針在復(fù)雜生物樣品中的潛在應(yīng)用，測(cè)得IC50值為0.10μmol/L。我們構(gòu)建的比率熒光檢測(cè)蛋白激酶的方法，不僅可以消除光源或檢測(cè)器的漂移以及環(huán)境條件等其他因素對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響和干擾，還實(shí)現(xiàn)了紫外燈下的可視化檢測(cè)。對(duì)今后磷酸化疾病的發(fā)現(xiàn)與早期診斷和對(duì)磷酸化相關(guān)疾病藥物及抗癌藥物的篩選與研發(fā)具有潛在應(yīng)用。
　　5、以同一激發(fā)不同發(fā)射的兩種生物礦化的金屬納米簇為雙發(fā)射同時(shí)檢測(cè)熒光探針，實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白激酶PKA和蛋白激酶CK2的同時(shí)檢測(cè)。以

12、蛋白激酶PKA和蛋白激酶CK2的底物多肽為模板分別制備發(fā)藍(lán)光的peptide-Cu NCs和發(fā)紅光的peptide-Au NCs。當(dāng)加入一種蛋白激酶時(shí)，只有相應(yīng)的多肽底物制備的金屬納米簇的熒光發(fā)生恢復(fù)，另一種金屬納米簇?zé)晒鈴?qiáng)度保持不變，則可對(duì)蛋白激酶進(jìn)行單獨(dú)檢測(cè)，并消除環(huán)境等因素對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，達(dá)到比率熒光檢測(cè)的效果，對(duì)蛋白激酶的鑒別與篩選具有重要意義。當(dāng)同時(shí)加入兩種蛋白激酶時(shí)，兩種金屬納米簇?zé)晒馔瑫r(shí)增強(qiáng)，從而達(dá)到對(duì)兩種蛋白激酶的同時(shí)