人工核酸切割分子與核酸相互作用的研究.pdf

1、人工核酸切割分子，又稱人工核酸酶，是用化學(xué)方法合成的一類能模擬天然核酸酶斷裂核酸骨架的功能小分子。它可以發(fā)展成為有用的分子生物學(xué)工具和基因治療藥物。本論文設(shè)計合成了一系列人工核酸斷裂分子，通過多種實驗手段研究了它們與核酸間的結(jié)合，斷裂及凝聚作用。
　　 本文選用對核酸堿基具有特異性識別能力的聚酰胺體系作為修飾分子，選用具有典型水解及自由基氧化斷裂機理的雙苯并咪唑(IDB)，單雙大環(huán)多胺(Cyclen or bis-Cyclen)

2、和抗壞血酸(Vc)為模型化合物，通過不同結(jié)構(gòu)柔性手臂連接構(gòu)成一系列新型核酸切割分子。旨在利用聚酰胺對核酸的特異性識別能力，提高和增強切割分子對核酸斷裂的選擇性及位點專一性。利用化學(xué)合成的方法對上述新型切割分子進(jìn)行合成及結(jié)構(gòu)表征。
　　 在切割分子對核酸的相互作用研究中，首先利用瓊脂糖凝膠電泳方法對比研究了三類切割小分子(IDB，Bis-Cyclen and Vc)與通過聚酰胺修飾后的新型斷裂試劑(Polyamide-IDB，Po

3、lyamide-Bis-Cyclenand Polyamide-Vc)對核酸斷裂作用的差異。實驗結(jié)果顯示，聚酰胺修飾后的切割分子，在相同條件下與原始切割分子相比對核酸的斷裂能力明顯增加，在較低的切割濃度下，可通過雙鏈切割有效將核酸斷裂為線形DNA。這種經(jīng)聚酰胺修飾提高核酸斷裂能力的結(jié)果不僅適用于水解型斷裂分子IDB和Cyclen，也適用于自由基氧化型斷裂分子Vc。此外，利用模型分析可知，Vc對核酸具有較明顯的隨機性雙鏈斷裂能力，通過聚酰

4、胺對Vc分子的修飾，將其對核酸的作用過程轉(zhuǎn)變?yōu)橛羞x擇性的非隨機性雙鏈斷裂。
　　 在人工核酸斷裂分子與核酸結(jié)合能力研究中，我們先后通過圓二色光譜，核酸熔點，熒光淬滅，紫外吸收光譜及Maldi-Tof等一系列光譜及質(zhì)譜方法量化分析了小分子斷裂試劑在通過聚酰胺體系修飾前后對核酸親和能力的變化。通過對比淬滅常數(shù)C50，核酸熔點差△Tm及表觀結(jié)合常數(shù)Kapp等結(jié)合常數(shù)可知，聚酰胺分子的引入，使小分子切割試劑與核酸間的相互作用增強，親和力

5、增加，作用模式由較弱的靜電吸引作用轉(zhuǎn)化為較強的溝槽式結(jié)合，并顯示出聚吡咯單元的聚酰胺分子對核酸中富AT序列具有明顯的特異性結(jié)合作用。
　　 在研究中我們意外發(fā)現(xiàn)，含酰胺結(jié)構(gòu)的多胺類分子金屬配合物在一定條件下對核酸具有凝聚作用。為此，我們以雙苯并咪唑(IDB)，三氮九員環(huán)多胺(TACN)，四氮十二員環(huán)多胺(Cyclen)為模型化合物，分別連接正丁基，正丁?；鸵宜嵋阴?gòu)成九種不同結(jié)構(gòu)不同側(cè)鏈的多胺類小分子配體，討論酰胺中羰基的存在

6、及位置對核酸凝聚的影響。首先合成并表征了上述九種配體分子及其金屬配合物。
　　 利用瓊脂糖凝膠電泳對比了多胺分子中不含羰基，含鄰位羰基及間位羰基與核酸的相互作用，結(jié)果顯示，只有側(cè)鏈中含鄰位羰基的多胺分子(即具有酰亞胺結(jié)構(gòu))在一定條件下對核酸具有凝聚作用，具有間位羰基的分子作用較弱，而含烷基側(cè)鏈的多胺分子對核酸無凝聚作用。其中，金屬鋅配合物在一定條件下可使pUC18質(zhì)粒DNA凝聚成為1000bp左右的條帶，而金屬銅配合物在凝聚核酸

7、同時，對核酸進(jìn)行不同程度的切割，因而凝聚成大小不同的核酸顆粒，電泳中顯示為彌散條帶。此外，通過濃度、溫度及時間梯度對比實驗證實，含鄰位羰基的多胺類金屬配合物對核酸的凝聚作用只發(fā)生在50℃和較高配合物濃度下，即配合物濃度與反應(yīng)溫度是發(fā)生凝聚作用的必要條件。選用不同種類的核酸進(jìn)行實驗發(fā)現(xiàn)，這種在一定條件下發(fā)生的凝聚作用對不同種類的核酸具有一定普遍性。
　　 原子力顯微鏡結(jié)果顯示，這種凝聚作用是以帶正電的小分子配合物為中心，通過靜電或