低氧狀態(tài)下水通道蛋白1參與細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基的轉(zhuǎn)運(yùn)及調(diào)節(jié)機(jī)制.pdf

1、目的：探討低氧狀態(tài)下水通道蛋白1(Aquaporin1，AQP1)是否參與活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)的轉(zhuǎn)運(yùn)。探討化學(xué)性低氧刺激下AQP1是否存在谷胱甘肽化修飾以及AQP1與ROS之間的關(guān)系。
　　方法：⑴構(gòu)建AQP1過(guò)表達(dá)細(xì)胞株:通過(guò)慢病毒感染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HumanUmbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC)，轉(zhuǎn)入帶有AQP1的基因序列的質(zhì)粒，建立穩(wěn)定過(guò)

2、表達(dá)AQP1的細(xì)胞株。⑵細(xì)胞低氧:AQP1過(guò)表達(dá)細(xì)胞與HUVEC正常細(xì)胞在96孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞80％-90％融合后更換培養(yǎng)基，在三氣孵育箱（設(shè)置參數(shù)為:1％O2、5％CO2、94％N2）中分別按0、2、4、6小時(shí)進(jìn)行低氧處理。⑶活性氧檢測(cè):低氧處理后細(xì)胞使用DCFH-DA探針?lè)跤?0min，洗去未進(jìn)入細(xì)胞的DCFH，通過(guò)酶標(biāo)儀在激發(fā)波長(zhǎng)485nm，發(fā)射波長(zhǎng)525nm條件下檢測(cè)各組細(xì)胞的OD值。⑷30μM碘乙酰胺處理Balb/3T3

3、成纖維細(xì)胞4小時(shí)。⑸免疫沉淀:裂解細(xì)胞后提取細(xì)胞內(nèi)蛋白，通過(guò)蛋白A—瓊脂糖珠連接抗體—抗原，純化細(xì)胞內(nèi)AQP1。⑹western blot:使用抗谷胱甘肽抗體或AQP1抗體檢測(cè)免疫沉淀得到的蛋白樣品。
　　結(jié)果：①在熒光顯微鏡下觀察慢病毒感染細(xì)胞的結(jié)果，與AQP1基因結(jié)合的GFP在細(xì)胞內(nèi)呈綠色熒光，如圖中所示，其余未轉(zhuǎn)入AQP1基因序列的在圖中呈黑色區(qū)域，圖中大部分細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，表明AQP1的基因序列成功導(dǎo)入宿主細(xì)胞。②無(wú)論是

4、在生理狀態(tài)還是低氧刺激下，AQP1過(guò)表達(dá)HUVEC與正常HUVEC其內(nèi)活性氧濃度存在差異，2小時(shí)處我們發(fā)現(xiàn)AQP1過(guò)表達(dá)組細(xì)胞較HUVEC正常細(xì)胞ROS濃度低，但結(jié)果不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P2=0.306)。而6小時(shí)處兩組細(xì)胞間結(jié)果沒(méi)有差異(P6=0.664)。③通過(guò)非還原SDS-PAGE于35Kd處沉淀所得AQP1，在同一位置處出現(xiàn)GSH條帶，且與陰性對(duì)照有明顯差別。
　　結(jié)論：水通道蛋白1無(wú)論是在生理狀態(tài)下還是細(xì)胞處于氧化應(yīng)激時(shí)，