擬南芥響應(yīng)低氮和低鈣分子機理研究.pdf

1、本實驗室以模式植物擬南芥為材料，研究植物對礦質(zhì)養(yǎng)分貧瘠響應(yīng)和適應(yīng)的分子機制。本論文由兩個相對獨立的課題組成:一方面通過突變體篩選比較深入的研究了RHD3基因在低氮誘導(dǎo)花青素過量積累過程中的分子功能;另一方面結(jié)合對活體細胞內(nèi)細胞質(zhì)Ca濃度的動態(tài)檢測和基因表達譜芯片技術(shù)，對植物感應(yīng)低Ca環(huán)境的細胞和分子生物學(xué)機制進行了初探。
　　(1)本研究篩選到一株在低氮條件下過量積累花青素的、隱性單基因突變體，表現(xiàn)主根短，根毛短而彎曲和植株矮小的

2、表型。結(jié)合圖位克隆與以二代測序技術(shù)為基礎(chǔ)的DNA多態(tài)性分析，確定突變基因為ROOT HAIR DEFECTIVE3(RHD3)，突變位點為第16個內(nèi)含子的最后一個堿基，導(dǎo)致RNA剪接錯誤，命名為rhd3-10，其所有表型同已知的rhd3-1以及rhd3-10/rhd3-1雜交F1代植物完全一致，證明我們觀察到的表型確實為RHD3基因突變造成。RHD3定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，基因啟動子活性集中在葉子和根尖。在rhd3-10突變體體內(nèi)引入花青素合成關(guān)

3、鍵基因TT4的突變，完全阻斷在低氮條件下rhd3-10過量積累花青素的表型。
　　在低氮條件下，rhd3-10相對于野生型植物(Col)，體內(nèi)花青素合成相關(guān)基因表達上調(diào)，花青素含量過量積累。證明在Col植物體內(nèi)，RHD3是低氮誘導(dǎo)花青素積累的負調(diào)控因子。乙烯是高光強誘導(dǎo)花青素積累的負調(diào)控因子。我們假設(shè)RHD3通過介導(dǎo)乙烯途徑間接負調(diào)控花青素積累。該假設(shè)得到如下四個結(jié)果的支持:(a) RHD3基因突變部分阻斷低氮對乙烯反應(yīng)基因表達的

4、誘導(dǎo);(b)在低氮條件下，乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)阻斷突變體，etr1、ein2、ein3/eil1表現(xiàn)出過量積累花青素的表型;而乙烯過量產(chǎn)生突變體eto1則表現(xiàn)出花青素積累顯著降低的表型。這證明，乙烯是低氮誘導(dǎo)花青素積累的負調(diào)控因子;(c)對于Col，乙烯合成前體ACC強烈抑制低氮誘導(dǎo)的花青素積累;對于乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)阻斷突變體和rhd3-10， ACC的這種抑制作用顯著降低;(d)在乙烯過量產(chǎn)生突變體eto1體內(nèi)進一步突變RHD3基因可以顯著提高突

5、變體花青素的積累。盡管RHD3和ETR1，EIN2和CTR1都位于或同內(nèi)質(zhì)網(wǎng)關(guān)聯(lián)，但是通過酵母雙雜交實驗沒有發(fā)現(xiàn)RHD3的N和C端同ETR1，EIN2和CTR1相互作用。RHD3調(diào)節(jié)乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機制還需要進一步研究。
　　(2)生態(tài)學(xué)證據(jù)表明，酸雨導(dǎo)致全球范圍土壤中Ca含量降低。植物應(yīng)對低Ca的分子和細胞學(xué)機制未知。本研究發(fā)現(xiàn)低Ca環(huán)境誘導(dǎo)大量基因表達發(fā)生顯著變化，其中很多基因是以前證明參與植物響應(yīng)其他逆境信號的基因。一類編

6、碼細胞質(zhì)Ca2+([Ca2+]cyt)感知蛋白的基因顯著上調(diào)，我們假設(shè)[Ca2+]cyt參與植物細胞感應(yīng)外界低Ca環(huán)境。研究證實，降低細胞外Ca2+濃度([Ca2+]ext)確實會激發(fā)[Ca2+]cyt瞬時升高，而且[Ca2+]cyt升高的峰值與[Ca2+]ext降低的程度呈正相關(guān)。通過提高細胞外K+濃度使細胞質(zhì)膜電勢相對去極化，顯著抑制[Ca2+]ext降低對[Ca2+]cyt的誘導(dǎo)作用，說明Ca2+可能通過受膜電勢調(diào)節(jié)的Ca通道進入

7、細胞內(nèi)。Gd3+，一個Ca2+通道抑制劑確實強烈抑制這個反應(yīng)。
　　動物細胞質(zhì)膜存在對細胞外低Ca感知的受體蛋白。受體調(diào)節(jié)的信號事件經(jīng)常表現(xiàn)脫敏現(xiàn)象:細胞在對第一次信號刺激作出反應(yīng)以后，需要一段時間的恢復(fù)才能對連續(xù)的第二次同樣信號刺激作出反應(yīng)。我們發(fā)現(xiàn)植物細胞對低Ca的反應(yīng)有顯著的時間依賴性的脫敏現(xiàn)象，但是對動物細胞Ca感知蛋白拮抗劑不敏感。磷脂酶C拮抗劑neomycin可以抑制細胞外低Ca對[Ca2+]cyt的誘導(dǎo)作用。進一步研

8、究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用Ca2+通道抑制劑Gd3+抑制低Ca引起的[Ca2+]cyt升高以后，可以抑制一部分低Ca誘導(dǎo)的下游基因表達，這說明植物細胞對低Ca環(huán)境在基因表達層面的響應(yīng)有依賴[Ca2+]cyt和不依賴[Ca2+]cyt兩條途徑。
　　綜上所述，本研究一方面在植物響應(yīng)低氮逆境方面鑒定到RHD3基因的新功能，并進一步證明RHD3通過調(diào)節(jié)乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實現(xiàn)對花青素合成的負調(diào)控功能。另一方面，本研究建立了植物響應(yīng)低鈣的基本細胞和基因轉(zhuǎn)錄