熱纖梭菌及生孢噬纖維粘菌降解結(jié)晶纖維素超分子結(jié)構(gòu)分析.pdf

1、高等植物所產(chǎn)生的纖維素是地球上最豐富的生物聚合物，其干重占整個(gè)植物細(xì)胞壁的40-60％。隨著化石燃料的日益緊缺，如何將不溶性的纖維素轉(zhuǎn)化成生物燃料成了人們所廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)。然而，在億萬(wàn)年的進(jìn)化過(guò)程中，植物進(jìn)化形成了具有超分子層次特點(diǎn)的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)以纖維素為核心骨架，外側(cè)包被半纖維素和木質(zhì)素，其可以有效抵御來(lái)自微生物和動(dòng)物的侵害，起到了結(jié)構(gòu)屏障的作用，即“生物質(zhì)抗降解屏障(biomassrecalcitrance)”。目前，充分利

2、用纖維素生物質(zhì)生產(chǎn)乙醇等燃料的主要障礙是缺乏低成本的降解轉(zhuǎn)化技術(shù)。
　　 纖維素酶對(duì)纖維素的降解是一個(gè)超分子結(jié)構(gòu)局部的降解過(guò)程，有特定的方向，有特定的接觸面，所以是一個(gè)非均質(zhì)的過(guò)程，因此，就產(chǎn)生了“有限反應(yīng)面積的問題”。從而，如何高效降解單根微纖絲甚至如何高效降解多根微纖絲就成了人們關(guān)注的新的科學(xué)問題。本研究主要從底物變化的角度，利用掃描電鏡、原子力顯微鏡以及切片技術(shù)、紅外光譜測(cè)定、XRD測(cè)定等分析熱纖梭菌和生孢噬纖維粘菌降解前

3、后結(jié)晶纖維素CF11和WhatmanNo1.濾紙的結(jié)構(gòu)等的變化，原位表征熱纖梭菌和生孢噬纖維粘菌對(duì)結(jié)晶纖維素的高效降解效率，期待澄清熱纖梭菌等對(duì)結(jié)晶纖維素的降解機(jī)制。本研究主要取得了以下研究成果:
　　 1、以ClostridiumthermocellumLQRⅠ作為菌株的微生物厭氧培養(yǎng)體系的建立。
　　 近年來(lái)對(duì)于熱纖梭菌降解纖維素的效率的研究大都趨于購(gòu)買纖維小體純品來(lái)對(duì)纖維素進(jìn)行降解，通過(guò)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析來(lái)表征熱纖梭菌

4、菌體對(duì)纖維素的降解效率，這具有一定的局限性。為了更有效地動(dòng)態(tài)觀察熱纖梭菌對(duì)纖維素的降解效率，同時(shí)表征降解過(guò)程中底物的變化和產(chǎn)物的變化是非常有必要的，然而，微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室均應(yīng)用好氧微生物體系進(jìn)行相關(guān)的研究，沒有厭氧微生物體系的現(xiàn)成的方法，本文建立了一套本實(shí)驗(yàn)室適用的微生物厭氧培養(yǎng)體系。
　　 2、可用于超微結(jié)構(gòu)分析測(cè)定的纖維素樣品處理方法構(gòu)建。
　　 熱線梭菌在降解結(jié)晶纖維的過(guò)程中，由于其是通過(guò)分泌纖維小體和游離

5、的纖維素酶對(duì)纖維素進(jìn)行降解的，殘余的纖維素表面會(huì)留有大量的菌體及蛋白等，這對(duì)后續(xù)的XRD測(cè)定以及超微結(jié)構(gòu)分析等都會(huì)造成干擾。通過(guò)利用0.05M焦磷酸鈉4℃過(guò)夜反復(fù)浸泡，單蒸水100℃煮沸30min的方法，結(jié)合紅外測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基本除去了纖維素表面的蛋白等雜質(zhì)，適宜用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)分析。
　　 3、首次實(shí)現(xiàn)原子力顯微鏡對(duì)纖維素整體超微結(jié)構(gòu)的觀測(cè)分析。
　　 本研究主要是利用原子力顯微鏡等觀察熱線梭菌等降解結(jié)晶纖維素前后，纖維

6、素超微結(jié)構(gòu)的變化，但是，原子力顯微鏡僅僅只能對(duì)纖維素的局部進(jìn)行掃描，不能很直觀地觀察到整體結(jié)構(gòu)的變化。通過(guò)采取對(duì)單根纖維細(xì)胞切片的連續(xù)掃描，最后利用JPK軟件包將所有掃描的圖片拼接起來(lái)的方法獲得單根纖維細(xì)胞切片的整體掃描圖，便能直觀地通過(guò)整根纖維細(xì)胞的變化情況。
　　 4、熱線梭菌降解纖維素過(guò)程中纖維素結(jié)構(gòu)觀測(cè)及酶動(dòng)力學(xué)性質(zhì)分析。
　　 熱纖梭菌可高效降解結(jié)晶纖維素。在48-72h內(nèi)，CF11含量由90％降至60％，PH

7、105的含量由90％降至37％。干燥樣品在1625cm-1處的紅外吸收峰隨降解時(shí)間逐漸增強(qiáng)證明在這一過(guò)程中纖維表面蛋白含量逐漸增加。XRD測(cè)定發(fā)現(xiàn)，降解前后結(jié)晶纖維素結(jié)晶度穩(wěn)定。以PH105為碳源的發(fā)酵過(guò)程中，最終可檢測(cè)到的還原糖的質(zhì)量為初始底物濃度的11％;CF11為碳源的發(fā)酵液中，最終可檢測(cè)到的還原糖的質(zhì)量為初始底物濃度的5％。培養(yǎng)基的pH值由7.5下降到6.0左右。對(duì)以PH105和CF11為碳源培養(yǎng)的熱纖梭菌隔天取樣的發(fā)酵液進(jìn)行S

8、DS電泳、活性電泳考染、CMC酶活性電泳、木聚糖酶活性電泳，其結(jié)果是是相一致的，SDS電泳用肉眼可以明顯分辨的蛋白條帶數(shù)為18條，其中分子量大于116kDa的蛋白條帶數(shù)為4條，主要蛋白分子量集中在45-116kDa之間。同時(shí)，通過(guò)活性電泳考染、CMC酶活性電泳以及木聚糖酶活性電泳圖譜可以看出，主要酶活性條帶集中在分離膠的上半部甚至濃縮膠點(diǎn)樣孔附近，第4天左右具有活性的蛋白含量達(dá)到最大值。
　　 5、熱纖梭菌以及生孢噬纖維粘菌降解

9、的結(jié)晶纖維素表面/切片的原子力顯微鏡觀測(cè)。
　　 利用原子力顯微鏡對(duì)熱纖梭菌降解的結(jié)晶纖維素的觀測(cè)可以得出，熱纖梭菌通過(guò)組裝纖維小體和分泌游離的纖維素酶系統(tǒng)對(duì)結(jié)晶纖維素進(jìn)行剝離式降解，纖維表面平坦整齊，通過(guò)切片觀測(cè)發(fā)現(xiàn)纖維素整體微纖絲的量由表面逐漸向里減少，殘余的微纖絲排列依然緊密。而生孢噬纖維粘菌由于其既不分泌游離的纖維素酶系，又不形成明顯的纖維小體，其對(duì)結(jié)晶纖維素的降解主要是依靠附著在菌體之上的酶系的作用，從而留下極為明顯的