石杉?jí)A甲對(duì)D-半乳糖致衰老大鼠肝臟lamin A-C、prelamin A及FACE1表達(dá)的影響.pdf

1、[背景]
　　核纖層(nuclear lamina)是一層內(nèi)核膜下約10nm厚的蛋白質(zhì)層，位于內(nèi)層核膜與染色質(zhì)之間，向外與內(nèi)層核膜上的蛋白結(jié)合，向內(nèi)與染色質(zhì)的特定區(qū)段結(jié)合，構(gòu)成貫穿于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的統(tǒng)一網(wǎng)架結(jié)構(gòu)體系。它們是核大小及形狀的主要決定因素，并且參與DNA復(fù)制及轉(zhuǎn)錄等基本活動(dòng)。核纖層主要結(jié)構(gòu)成分是纖層蛋白(lamin)，一定數(shù)量的成熟核纖層蛋白對(duì)于維持細(xì)胞的正常功能是必需的。心臟、肝臟和腎臟等多個(gè)組織中均有大量lamin

2、A和lamin C，且laminA的量較lamin C稍多。研究表明軟骨細(xì)胞中l(wèi)amin A過度表達(dá)可促進(jìn)老化并導(dǎo)致凋亡，prelamin A聚集可加速血管平滑肌細(xì)胞老化，而prelamin A聚集與lamin A加工酶FACE1的下調(diào)相關(guān)。但是，對(duì)于老化肝臟中l(wèi)amin A/C、prelamin A及FACE1的表達(dá)變化的研究較少。石杉?jí)A甲是可逆性的、選擇性的AChE抑制劑，具有抗氧化、抗凋亡、降低活性氧自由基、提高呼吸鏈或三羧酸循環(huán)

3、中的關(guān)鍵酶活性等作用，臨床上已經(jīng)廣泛用于治療輕中度阿爾茨海默病。但是，石杉?jí)A甲對(duì)于肝臟老化的改善作用至今未明。
　　[目的]
　　1.應(yīng)用D-半乳糖制造衰老大鼠模型，研究其肝臟lamin A/C、prelamin A及FACE1表達(dá)變化，明確肝臟衰老與lamin A/C、prelaminA及FACE1的關(guān)系。
　　2.通過研究石杉?jí)A甲對(duì)肝臟lamin A/C、prelaminA及FACE1的表達(dá)影響，明確石杉?jí)A甲對(duì)肝臟

4、老化的保護(hù)作用。
　　3.探討lamins導(dǎo)致老化的機(jī)制以及石杉?jí)A甲對(duì)肝臟老化的保護(hù)作用的機(jī)制。
　　[方法]
　　1.2月齡雄性SD大鼠隨機(jī)分成三組:
　　(1)D-半乳糖治療組(n=12)
　　(2) D-半乳糖聯(lián)合石杉?jí)A甲治療組(n=12)
　　(3)對(duì)照組(n=12)。
　　D-半乳糖治療組每天皮下注射D-半乳糖300mg/Kg，共8周;D-半乳糖聯(lián)合石杉?jí)A甲組每天D-半乳糖300mg/

5、Kg聯(lián)合石杉?jí)A甲0.1 mg/Kg共同皮下注射，共8周;對(duì)照組每天皮下注射等量生理鹽水，共8周。每組選擇三只大鼠，腹腔內(nèi)注射5-溴脫氧尿嘧啶核苷(Brdu)，每6小時(shí)注射1次，共3次(100mg/kg b.w.)標(biāo)記增生期肝細(xì)胞，最后一次注射6小時(shí)后殺死動(dòng)物，留取組織。
　　2.應(yīng)用免疫組化的方法檢測表達(dá)衰老相關(guān)β半乳糖酶(SA-β-Gal)的肝細(xì)胞、被Brdu標(biāo)記的增生期肝細(xì)胞以及出現(xiàn)氧化應(yīng)激DNA損傷標(biāo)記物8-氧鳥嘌呤(8-o

6、xoG)的肝細(xì)胞;應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)的方法研究p16、TNF-α及IL-6的基因表達(dá)。應(yīng)用二氯熒光黃(DCF)探針研究ROS的水平;應(yīng)用半定量Western blot分析p65、磷酸化p65、IκBα、TNF-α及IL-6的水平。
　　3.應(yīng)用免疫組化和蛋白免疫印跡雜交(Western blot)方法檢測三組大鼠肝臟組織中l(wèi)amin A/C、prelaminA和FACE1的表達(dá)。
　　4.應(yīng)用分光光度測量法

7、測定AChE活性。
　　[結(jié)果]
　　1.對(duì)照組、D-半乳糖+石杉?jí)A甲組、D-半乳糖組大鼠中表達(dá)SA-β-Gal的肝細(xì)胞逐漸增多;Brdu標(biāo)記的增生細(xì)胞數(shù)量逐漸降低;8-oxoG抗體標(biāo)記的肝細(xì)胞數(shù)量逐漸升高;肝細(xì)胞p16mRNA水平逐漸升高;ROS（nmol/min/mg蛋白）水平逐漸升高。與對(duì)照組相比，D-半乳糖組肝細(xì)胞TNF-α mRNA水平明顯升高，D-半乳糖+石杉?jí)A甲組無明顯變化;IL-6 mRNA水平逐漸升高。We

8、sternblot分析顯示TNF-α水平在D-半乳糖組中最高，D-半乳糖+石杉?jí)A甲組中最低;IL-6水平在三組中逐漸升高。核p65及磷酸化p65水平逐漸升高;胞漿p65水平在D-半乳糖組最低，D-半乳糖+石杉?jí)A甲組中最高，IκBα水平在三組中逐漸降低。
　　2.對(duì)照組、D-半乳糖+石杉?jí)A甲組、D-半乳糖組中l(wèi)amin A及l(fā)amin A/C抗體標(biāo)記的肝細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，著色加深;FACE1抗體標(biāo)記的肝細(xì)胞數(shù)量逐漸減少。Wester

9、n blot分析顯示lamin A/C水平逐漸升高，prelamin A水平逐漸升高，F(xiàn)ACE1水平逐漸降低。
　　3.對(duì)照組、D-半乳糖+石杉?jí)A甲組、D-半乳糖組中肝臟AChE活性（U/mg蛋白）分別為:0.103±0.00790 vs0.0702±0.00521 vs0.0926±0.00447。
　　[結(jié)論]
　　Lamin A/C、prelamin A升高，F(xiàn)ACE1降低預(yù)示著D-半乳糖誘導(dǎo)的大鼠肝臟衰老。石杉