D-半乳糖誘導(dǎo)大鼠內(nèi)耳氧化性應(yīng)激、線粒體損傷和凋亡及長(zhǎng)期高脂飲食對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)的老化大鼠內(nèi)耳的影響.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分 D-半乳糖誘導(dǎo)大鼠內(nèi)耳氧化性應(yīng)激、線粒體損傷和凋亡
　　目的:線粒體 DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)的氧化性損傷和凋亡是老化的重要特征。之前利用連續(xù)8周注射 D-半乳糖(D-galactose, D-gal)的方法建立了大鼠老化模型,并且發(fā)現(xiàn)在 D-gal誘導(dǎo)的老化大鼠內(nèi)耳中氧化性應(yīng)激的增加和mtDNA常見缺失(common deletion, CD

2、)的增加。但是,在 D-gal誘導(dǎo)的老化大鼠內(nèi)耳中,目前沒(méi)有直接的證據(jù)表明 mtDNA CD的累積是由氧化性損傷引起的;同時(shí)此模型內(nèi)耳中活性氧(reactive oxygen species, ROS)的來(lái)源以及凋亡情況仍不清楚。
　　方法:聽力正常,無(wú)中耳疾患的40只5周齡雄性 Spragua-Dawley大鼠隨機(jī)分成2組(各20只):① D-半乳糖組(D-gal group):每日頸背部皮下注射 D-gal(500mg/kg)

3、,連續(xù)8周;②對(duì)照組(control group):每日頸背部皮下注射同體積的生理鹽水,連續(xù)8周。聽性腦干反應(yīng)(auditory brainstem response, ABR)檢測(cè)每組大鼠聽功能。比色法檢測(cè)大鼠血清 H2O2,總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase, T-SOD)活性以及丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量。實(shí)時(shí)定量 PCR檢測(cè)大鼠內(nèi)耳 mtDNA CD的累積以及NAD

4、PH氧化酶3(NOX3)和P22phox mRNA水平的變化。透射電子顯微鏡檢術(shù)(Transmission Electron Microscopy, TEM)觀察大鼠內(nèi)耳組織細(xì)胞中線粒體超微結(jié)構(gòu)的改變。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大鼠耳蝸8-羥基-2-脫氧鳥苷(8-hydroxy-2-deoxyguanosine,8-OHdG)以及NOX3和P22phox蛋白水平的變化。免疫印跡法檢測(cè)大鼠內(nèi)耳組織中激活型 caspase-3(cleaved ca

5、spase-3)的表達(dá)。原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記( terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT)-mediated deoxyuridine triphosphate(dUTP) nick-end-labelling, TUNEL)染色檢測(cè)大鼠耳蝸細(xì)胞凋亡發(fā)生的情況。
　　結(jié)果:D-半乳糖組大鼠血清 H2O2和MDA含量比對(duì)照組明顯增加,T-SOD水平比對(duì)照組明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0

6、1)。D-半乳糖組大鼠內(nèi)耳組織中mtDNA CD累積比對(duì)照組明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。TEM發(fā)現(xiàn) D-半乳糖組大鼠耳蝸組織細(xì)胞中線粒體表現(xiàn)為基質(zhì)密度降低,甚至發(fā)生嚴(yán)重變性。D-半乳糖組大鼠耳蝸組織中8-OHdG、NOX3、P22phox和cleaved caspase-3的表達(dá)比對(duì)照組明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。TUNEL染色發(fā)現(xiàn)少量凋亡細(xì)胞局限于 D-半乳糖組大鼠耳蝸血管紋,而對(duì)照組大鼠耳蝸未發(fā)現(xiàn)凋亡

7、細(xì)胞。兩組大鼠ABR閾值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　結(jié)論:在內(nèi)耳老化過(guò)程中mtDNA CD的積累可能是 NADPH氧化酶相關(guān)的氧化性應(yīng)激造成的,并且 caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可能參與了內(nèi)耳的老化過(guò)程。
　　第二部分 長(zhǎng)期高脂飲食加重 D-半乳糖誘導(dǎo)的老化大鼠內(nèi)耳氧化性應(yīng)激,線粒體損傷和凋亡
　　目的:研究12個(gè)月的高脂飲食對(duì) Sprague-Dawley大鼠內(nèi)耳及D-半乳糖誘導(dǎo)的老化大鼠內(nèi)耳的老化過(guò)

8、程的作用。
　　方法:104只5周齡雄性 Spragua-Dawley大鼠隨機(jī)分成4組(各26只):①對(duì)照組(control group):飼喂基礎(chǔ)飲食12個(gè)月,前8周每日頸背部皮下注射和D-半乳糖組同體積的生理鹽水;② D-半乳糖組(D-gal group):飼喂基礎(chǔ)飲食12個(gè)月,前8周每日頸背部皮下注射 D-gal(500mg/kg);③高脂飲食組(HFD group):飼喂高脂飲食12個(gè)月,前8周每日頸背部皮下注射和D-半乳

9、糖組同體積的生理鹽水;④ D-半乳糖+高脂飲食組(D-gal+HFD group):飼喂高脂飲食12個(gè)月,前8周每日頸背部皮下注射 D-gal(500mg/kg)。造模結(jié)束后,聽性腦干反應(yīng)(auditory brainstem response, ABR)檢測(cè)每組大鼠聽功能;每組大鼠稱重,比色法檢測(cè)大鼠血清甘油三脂(triglycerides, TG),總膽固醇(total cholesterol, TC),游離脂肪酸(nonester

10、ified fatty acids, NEFA)和H2O2含量;實(shí)時(shí)定量 PCR檢測(cè)大鼠內(nèi)耳 mtDNA CD的累積以及NADPH氧化酶3(NOX3), P22phox, uncoupling protein2(UCP2)和uncoupling protein3(UCP3)mRNA水平的變化;免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大鼠耳蝸 NOX3蛋白水平的表達(dá);免疫印跡法檢測(cè)大鼠內(nèi)耳組織中NOX3, P22phox, UCP2, UCP3和激活型 cas

11、pase-3(cleaved caspase-3)的蛋白水平的表達(dá);透射電子顯微鏡檢術(shù)(Transmission Electron Microscopy, TEM)觀察大鼠耳蝸血管紋邊緣細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)的改變;原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記(terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT)-mediated deoxyuridine triphosphate(dUTP) nick-end-labelling,

12、TUNEL)染色檢測(cè)大鼠耳蝸細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果:D-半乳糖組和D-半乳糖+高脂飲食組大鼠ABR閾值在4,8,16和32 kHz比對(duì)照組升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);高脂飲食組大鼠ABR閾值數(shù)值上在上述4個(gè)頻率均比對(duì)照組升高,但僅在32 kHz差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);同時(shí),D-半乳糖+高脂飲食組大鼠ABR閾值在16和32 kHz比 D-半乳糖組升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高脂飲食組和D-半乳糖+

13、高脂飲食組大鼠血清 TG、TC和NEFA水平比對(duì)照組和D-半乳糖組升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);D-半乳糖組、高脂飲食組和D-半乳糖+高脂飲食組大鼠血清 H2O2水平比對(duì)照組升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),其中D-半乳糖+高脂飲食組大鼠血清 H2O2水平最高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。D-半乳糖組、高脂飲食組和D-半乳糖+高脂飲食組大鼠內(nèi)耳組織 NOX3、P22phox、UCP2、UCP3和cleaved ca

14、spase-3的表達(dá)比對(duì)照組升高,其中D-半乳糖+高脂飲食組最高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。D-半乳糖組、高脂飲食組和D-半乳糖+高脂飲食組大鼠內(nèi)耳組織 mtDNA CD的累積比對(duì)照組增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。D-半乳糖組、高脂飲食組和D-半乳糖+高脂飲食組大鼠耳蝸血管紋邊緣細(xì)胞線粒體有不同程度的腫脹,伴有線粒體基質(zhì)密度降低。TUNEL染色發(fā)現(xiàn) D-半乳糖組、高脂飲食組和D-半乳糖+高脂飲食組凋亡細(xì)胞比對(duì)照組明顯增