可降解大米生淀粉的α-淀粉酶AmyP的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系.pdf

1、α-淀粉酶(EC3.2.1.1)可作用于淀粉、多糖及寡糖內(nèi)部的α-1，4-葡萄糖苷鍵，產(chǎn)生α-異頭物構(gòu)型保留的低聚麥芽糖和葡糖糖。α-淀粉酶在淀粉轉(zhuǎn)換成低聚糖的過(guò)程中起著非常重要的作用，因此對(duì)于以淀粉作為基本能量來(lái)源的有機(jī)體來(lái)說(shuō)是至關(guān)重要的。另外，α-淀粉酶在食品、發(fā)酵、制藥以及生物燃料等工業(yè)領(lǐng)域也得到了廣泛的應(yīng)用。
　　在根據(jù)蛋白質(zhì)的序列同源性分類的CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)中，GH13家族被認(rèn)為是最主要的α-淀粉酶家族，與GH70和GH7

2、7家族共同形成了具有（β/α）8（或稱TIM）桶式折疊催化結(jié)構(gòu)域的GH-H宗族。GH13家族α-淀粉酶具有4-7個(gè)保守的序列區(qū)，包括了Asp-Glu-Asp的催化三聯(lián)體和重要的底物結(jié)合位點(diǎn)，且都實(shí)行保留催化機(jī)制。根據(jù)序列相似性的程度，目前在CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)上將GH13家族分成了42個(gè)亞家族。α-淀粉酶分布于其中的11個(gè)亞家族當(dāng)中，其中GH13_37亞家族是最新建立的。它的建立是基于從海洋宏基因組文庫(kù)中篩選到的一個(gè)新穎的細(xì)菌α-淀粉酶Amy

3、P。AmyP能快速偏好降解大米生淀粉，水解淀粉的終產(chǎn)物由葡萄糖、麥芽糖和麥芽三糖組成。AmyP由N-末端的催化結(jié)構(gòu)域和C-末端的淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域SBD組成。目前為止，GH13_37亞家族除了AmyP，還包括56個(gè)假定的成員，這些成員大多數(shù)來(lái)自海洋細(xì)菌。
　　為了更好地認(rèn)識(shí)這個(gè)新的亞家族，我們解析了AmyP催化結(jié)構(gòu)域酶活缺失突變體AmyPΔSBD-E221Q與麥芽三糖復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，Glu221是酶的三個(gè)保守催化位點(diǎn)中的一個(gè)。然后基

4、于結(jié)構(gòu)分析構(gòu)建了不同的突變體進(jìn)行了相應(yīng)的生化和酶學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。AmyPΔSBD的結(jié)構(gòu)與其他GH13家族α-淀粉酶的結(jié)構(gòu)相似，由3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，分別是domainA，domain B和domain C。DomainA是典型的包含催化位點(diǎn)的（β/α）8桶結(jié)構(gòu)，domainC是由反平行的八股β-折疊片組成，而domainB是目前已報(bào)道的GH13家族α-淀粉酶中最短的，形成一段從domain A伸出的loop，沒(méi)有通常位于domain A和dom

5、ain B之間的鈣離子結(jié)合位點(diǎn)。這樣一個(gè)小的domain B使AmyPΔSBD相比其它GH13家族α-淀粉酶呈現(xiàn)一個(gè)更開放的底物結(jié)合口袋，利于生淀粉顆粒表面的接近和生淀粉的水解。Domain B緊鄰活性中心，同樣有助于穩(wěn)固AmyPΔSBD活性位點(diǎn)的構(gòu)象和增強(qiáng)酶的熱穩(wěn)定性。另外，四個(gè)半胱氨酸殘基兩兩形成二硫鍵(Cys2-Cys243和Cys359-Cys365)，位于domainA中，這在GH13_37亞家族中是保守的。大多數(shù)GH13家族

6、α-淀粉酶在domain A和domain B結(jié)構(gòu)域的界面間存在保守的鈣離子結(jié)合位點(diǎn)，參與酶分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，增強(qiáng)其活性和熱穩(wěn)定性。而AmyPΔSBD在Domain A邊緣有兩個(gè)鈣離子結(jié)合位點(diǎn)，其中一個(gè)很新穎，靠近-3糖單元結(jié)合位點(diǎn)。因此，鈣離子的結(jié)合有助于增強(qiáng)酶的熱穩(wěn)定性。此外，在底物結(jié)合-3亞位點(diǎn)，酶的Tyr36殘基與-3糖單元形成疏水和氫鍵相互作用，這與在水解淀粉的初期，野生型主要產(chǎn)生麥芽三糖，而Y36A突變體主要產(chǎn)生麥芽糖的結(jié)果是