馬鈴薯α-淀粉酶基因和黑曲霉γ-淀粉酶基因的分子克隆及其在畢赤酵母菌中的表達.pdf

1、傳統(tǒng)的乙醇是利用糧食通過高溫蒸煮發(fā)酵的方法生產，考慮到傳統(tǒng)酒精發(fā)酵工業(yè)高能耗、原料缺乏、高污染、發(fā)酵酒精度偏低等弊端。本實驗選擇了以馬鈴薯淀粉為發(fā)酵原料，生產乙醇符合國家節(jié)能減排的產業(yè)政策。利用基因操作技術克隆了馬鈴薯來源的α-淀粉酶基因以及具有黑曲霉來源的耐酸耐高溫γ-淀粉酶基因，經體外構建后分別導入酵母菌，獲得了可有效降解馬鈴薯淀粉的轉基因畢赤酵母工程菌，通過接種釀酒酵母厭氧發(fā)酵獲得乙醇。
　　 實驗主要研究結果如下：

2、>　　 1、以夏波蒂馬鈴薯總RNA為模板，根據α-淀粉酶基因保守區(qū)序列設計合成了引物，通過RT-PCR法獲得α-淀粉酶基因(amyA)，利用平末端克隆技術將其克隆至pET32a上進行測序，測序結果表明該基因全長1224 bp，編碼406個氨基酸。通過生物信息學分析54-1224bp為編碼成熟肽基因，又設計了引物克隆獲得成熟肽基因(Namy)，同時將其亞克隆至pPIC9k，構建重組表達質粒pkamyA轉化畢赤酵母GS115，利用錐蟲藍法

3、篩選獲得高表達淀粉酶活性菌株GSamyA5，對該菌株進行培養(yǎng)，0.5％(v/v)甲醇誘導表達72h，利用SDS-PAGE電泳分析表達上清液，發(fā)現(xiàn)GSamyA5表達的特異蛋白條帶，約為42kDa。對重組粗酶酶學性質分析表明：該酶作用的最適pH值為6.0，最適作用溫度為45℃，熱穩(wěn)定性及抗酸堿性較差，且金屬離子Ca2+、K+、Zn2+對其酶活有促進作用，而Cu2+、Fe2+、Fe3+有抑制作用。
　　 2、以黑曲霉總RNA為模板，根

4、據γ-淀粉酶基因保守區(qū)序列設計合成了引物，通過RT-PCR法獲得γ-淀粉酶基因(amyC)，利用平末端克隆技術將其克隆至pET32a上進行測序，測序結果表明該基因全長1996bp，編碼604個氨基酸。同時將其亞克隆至pPIC9k，構建重組表達質粒pkamyC轉化畢赤酵母GS115，利用錐蟲藍法篩選獲得高表達淀粉酶活性菌株GSamyC3，對該菌株進行培養(yǎng)，0.5％(v/v)甲醇誘導表達72h，利用SDS-PAGE電泳分析表達上清液，發(fā)現(xiàn)G

5、SamyC3表達的特異蛋白條帶，約為68kDa。對重組粗酶酶學性質分析表明：該酶作用的最適pH值為4.6，最適作用溫度為60℃，熱穩(wěn)定性及抗酸堿性良好，且金屬離子Ca2+、Na+對其酶活行促進作用，而Cu2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+有抑制作用。
　　 3、以馬鈴薯淀粉為原料，按1％接種量分別接種轉α-淀粉酶基因和γ-淀粉酶基因酵母工程菌，甲醇誘導表達36h后二次接種轉γ-淀粉酶基因酵母菌，再添加5％釀酒酵母進行厭氧發(fā)酵，生