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文檔簡介
1、傳統(tǒng)的乙醇是利用糧食通過高溫蒸煮發(fā)酵的方法生產(chǎn),考慮到傳統(tǒng)酒精發(fā)酵工業(yè)高能耗、原料缺乏、高污染、發(fā)酵酒精度偏低等弊端。本實(shí)驗(yàn)選擇了以馬鈴薯淀粉為發(fā)酵原料,生產(chǎn)乙醇符合國家節(jié)能減排的產(chǎn)業(yè)政策。利用基因操作技術(shù)克隆了馬鈴薯來源的α-淀粉酶基因以及具有黑曲霉來源的耐酸耐高溫γ-淀粉酶基因,經(jīng)體外構(gòu)建后分別導(dǎo)入酵母菌,獲得了可有效降解馬鈴薯淀粉的轉(zhuǎn)基因畢赤酵母工程菌,通過接種釀酒酵母厭氧發(fā)酵獲得乙醇。
實(shí)驗(yàn)主要研究結(jié)果如下:
2、> 1、以夏波蒂馬鈴薯總RNA為模板,根據(jù)α-淀粉酶基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)合成了引物,通過RT-PCR法獲得α-淀粉酶基因(amyA),利用平末端克隆技術(shù)將其克隆至pET32a上進(jìn)行測序,測序結(jié)果表明該基因全長1224 bp,編碼406個(gè)氨基酸。通過生物信息學(xué)分析54-1224bp為編碼成熟肽基因,又設(shè)計(jì)了引物克隆獲得成熟肽基因(Namy),同時(shí)將其亞克隆至pPIC9k,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pkamyA轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,利用錐蟲藍(lán)法
3、篩選獲得高表達(dá)淀粉酶活性菌株GSamyA5,對該菌株進(jìn)行培養(yǎng),0.5%(v/v)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)72h,利用SDS-PAGE電泳分析表達(dá)上清液,發(fā)現(xiàn)GSamyA5表達(dá)的特異蛋白條帶,約為42kDa。對重組粗酶酶學(xué)性質(zhì)分析表明:該酶作用的最適pH值為6.0,最適作用溫度為45℃,熱穩(wěn)定性及抗酸堿性較差,且金屬離子Ca2+、K+、Zn2+對其酶活有促進(jìn)作用,而Cu2+、Fe2+、Fe3+有抑制作用。
2、以黑曲霉總RNA為模板,根
4、據(jù)γ-淀粉酶基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)合成了引物,通過RT-PCR法獲得γ-淀粉酶基因(amyC),利用平末端克隆技術(shù)將其克隆至pET32a上進(jìn)行測序,測序結(jié)果表明該基因全長1996bp,編碼604個(gè)氨基酸。同時(shí)將其亞克隆至pPIC9k,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pkamyC轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,利用錐蟲藍(lán)法篩選獲得高表達(dá)淀粉酶活性菌株GSamyC3,對該菌株進(jìn)行培養(yǎng),0.5%(v/v)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)72h,利用SDS-PAGE電泳分析表達(dá)上清液,發(fā)現(xiàn)G
5、SamyC3表達(dá)的特異蛋白條帶,約為68kDa。對重組粗酶酶學(xué)性質(zhì)分析表明:該酶作用的最適pH值為4.6,最適作用溫度為60℃,熱穩(wěn)定性及抗酸堿性良好,且金屬離子Ca2+、Na+對其酶活行促進(jìn)作用,而Cu2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+有抑制作用。
3、以馬鈴薯淀粉為原料,按1%接種量分別接種轉(zhuǎn)α-淀粉酶基因和γ-淀粉酶基因酵母工程菌,甲醇誘導(dǎo)表達(dá)36h后二次接種轉(zhuǎn)γ-淀粉酶基因酵母菌,再添加5%釀酒酵母進(jìn)行厭氧發(fā)酵,生
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