擴展青霉脂肪酶基因克隆、密碼子優(yōu)化及表達.pdf

1、脂肪酶是一種重要的工業(yè)酶，在自然界中普遍存在，目前許多脂肪酶基因已被克隆，并獲得相應(yīng)高效表達的工程菌。擴展青霉脂肪酶是一種中溫堿性脂肪酶，可在堿性條件下分解三酰甘油酯,在工業(yè)上有著廣泛的應(yīng)用。本研究以擴展青霉（Penicillium expansum）CICC 40356 為出發(fā)菌，利用PCR和RT-PCR 克隆了擴展青霉脂肪酶基因（PEL）及其開放閱讀框（ORF），并對基因中低使用頻率密碼子進行了優(yōu)化，使其在異源宿主Pichia pa

2、storis GS115中獲得了理想的表達效果，并對重組脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)進行了初步研究。主要工作如下。
　　 (1)分別利用PCR和RT-PCR 克隆了擴展青霉（P. Expansum）CICC 40356脂肪酶基因（PEL）及其開放閱讀框（ORF）。序列分析顯示該基因由6個外顯子和個內(nèi)含子組成，基因全長1140 bp，ORF為858 bp，編碼286個氨基酸殘基，與GenBank中已報道的PEL基因序列的同源性為99%。

3、>　　 (2)外源蛋白的異源表達水平與多種因素有關(guān)，其中密碼子偏愛性是重要影響因素。為了獲得高效表達的擴展青霉脂肪酶，利用重疊延伸PCR（Over-lap extensionPCR）技術(shù)對PEL的10個氨基酸密碼子和表達載體pPIC9Kα信號肽的9個氨基酸密碼子進行了優(yōu)化，獲得了改造過的脂肪酶基因PELM和表達載體pPIC9KM。
　　 并構(gòu)建了帶有脂肪酶自身信號肽的pPIC9K-PEL1、pPIC9KM-PELM1、pPIC

4、3.5K-PEL1、pPIC3.5K-PELM1和不帶有脂肪酶自身信號肽的pPIC9K-PEL2、pPIC9KM-PELM2 六個重組質(zhì)粒。表達載體經(jīng)Sal I 線性化后電轉(zhuǎn)化至P.pastorisGS115中進行表達。經(jīng)過MD、MM、活性功能檢測平板及G418 篩選得到最佳畢赤酵母GS115轉(zhuǎn)化子，在搖瓶中甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵100h后，利用pNPP 比色法測得發(fā)酵上清的酶活分別為3.65 U/ml，30.49 U/ml，90.85 U/ml

5、，212.05 U/ml，15.29 U/ml，76.32 U/ml。發(fā)酵上清液經(jīng)硫酸銨沉淀、透析，透析產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE檢測，發(fā)現(xiàn)28 kDa 左右的特異性蛋白條帶。
　　 (3)對重組擴展青霉脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)進行了初步研究。結(jié)果表明：擴展青霉脂肪酶的最適溫度為35℃，最適pH為9.5，在pH 7.0-10.0 范圍內(nèi)該脂肪酶均較穩(wěn)定；最適底物為C8，對中鏈酯（C8-C12）有較強的水解能力；Ca2+和Mg2+對其有激活作