β-半乳糖苷酶基因gzd的表達(dá)及密碼子優(yōu)化.pdf

1、β—半乳糖苷酶(β—galactosidase EC．3.2.1.23)通常被稱為乳糖酶，廣泛存在于植物、細(xì)菌、真菌、放線菌以及動(dòng)物腸道中。該酶能將乳糖水解為半乳糖和葡萄糖，并具有轉(zhuǎn)移半乳糖苷的作用，主要用于治療乳糖不耐受癥，處理加工牛奶、乳清，生產(chǎn)低乳糖牛奶和乳制品。近幾年，隨著人們對(duì)乳糖不耐受癥認(rèn)識(shí)的深入，β—半乳糖苷酶在食品和乳制品工業(yè)中的作用日益顯著。 本實(shí)驗(yàn)室在過(guò)去的研究工作中，分離到一株能夠產(chǎn)β—半乳糖苷酶的低溫鹽堿

2、菌Planococcus sp．L3，并通過(guò)構(gòu)建基因文庫(kù)的方法克隆到一個(gè)新的β—半乳糖苷酶基因gzd。本文在此基礎(chǔ)上，將該基因分別構(gòu)建到原核表達(dá)載體pQE—30、pET—32a、pET—41a以及pET—44a中，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌E．coli BL21(DE3)。在37℃條件下，用終濃度為0.125 mM IPTG誘導(dǎo)8小時(shí)，結(jié)果顯示，gzd在四種表達(dá)載體中的表達(dá)量均很低。 β—半乳糖苷酶Gzd的最適反應(yīng)溫度為46℃，45-70℃

3、保溫2h，酶活力完全消失。該酶的最適pH值為9.0，在pH7.0-10.0之間，酶活力較穩(wěn)定。分別加入終濃度為10 mM Ca2+和1 mM Mn2+，可使Gzd的酶活力提高71.9％和35.9％，而Cu12+和Zn2+對(duì)Gzd有著強(qiáng)烈的抑制作用。該酶水解ONPG和乳糖的米氏常數(shù)Km分別為0.64和0.21μmol/ml，最大反應(yīng)速率Vmax分別是0.23和0.45μmol/min。 基因gzd在大腸桿菌中表達(dá)量很低。通過(guò)軟件分

4、析發(fā)現(xiàn)，gzd中約有60％的密碼子為大腸桿菌非偏好密碼子。為了進(jìn)一步提高gzd的表達(dá)量，本論文利用OE—PCR的基因拼接技術(shù)對(duì)gzd進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，成功獲得了全部由大腸桿菌偏好密碼子組成的基因gzd。但由于時(shí)間關(guān)系，密碼子優(yōu)化后的gzd表達(dá)研究目前仍在進(jìn)行中。 采用真核高效表達(dá)系統(tǒng)—乳酸克魯維酵母分泌表達(dá)系統(tǒng)研究了基因gzd的異源表達(dá)情況。SDS—PAGE電泳結(jié)果顯示，gzd在乳酸克魯維酵母中的表達(dá)量很低，推測(cè)可能是由于目的基