β-半乳糖苷酶基因gzd的表達及密碼子優(yōu)化.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、β—半乳糖苷酶(β—galactosidase EC.3.2.1.23)通常被稱為乳糖酶,廣泛存在于植物、細菌、真菌、放線菌以及動物腸道中。該酶能將乳糖水解為半乳糖和葡萄糖,并具有轉移半乳糖苷的作用,主要用于治療乳糖不耐受癥,處理加工牛奶、乳清,生產低乳糖牛奶和乳制品。近幾年,隨著人們對乳糖不耐受癥認識的深入,β—半乳糖苷酶在食品和乳制品工業(yè)中的作用日益顯著。 本實驗室在過去的研究工作中,分離到一株能夠產β—半乳糖苷酶的低溫鹽堿

2、菌Planococcus sp.L3,并通過構建基因文庫的方法克隆到一個新的β—半乳糖苷酶基因gzd。本文在此基礎上,將該基因分別構建到原核表達載體pQE—30、pET—32a、pET—41a以及pET—44a中,并轉化大腸桿菌E.coli BL21(DE3)。在37℃條件下,用終濃度為0.125 mM IPTG誘導8小時,結果顯示,gzd在四種表達載體中的表達量均很低。 β—半乳糖苷酶Gzd的最適反應溫度為46℃,45-70℃

3、保溫2h,酶活力完全消失。該酶的最適pH值為9.0,在pH7.0-10.0之間,酶活力較穩(wěn)定。分別加入終濃度為10 mM Ca2+和1 mM Mn2+,可使Gzd的酶活力提高71.9%和35.9%,而Cu12+和Zn2+對Gzd有著強烈的抑制作用。該酶水解ONPG和乳糖的米氏常數(shù)Km分別為0.64和0.21μmol/ml,最大反應速率Vmax分別是0.23和0.45μmol/min。 基因gzd在大腸桿菌中表達量很低。通過軟件分

4、析發(fā)現(xiàn),gzd中約有60%的密碼子為大腸桿菌非偏好密碼子。為了進一步提高gzd的表達量,本論文利用OE—PCR的基因拼接技術對gzd進行了密碼子優(yōu)化,成功獲得了全部由大腸桿菌偏好密碼子組成的基因gzd。但由于時間關系,密碼子優(yōu)化后的gzd表達研究目前仍在進行中。 采用真核高效表達系統(tǒng)—乳酸克魯維酵母分泌表達系統(tǒng)研究了基因gzd的異源表達情況。SDS—PAGE電泳結果顯示,gzd在乳酸克魯維酵母中的表達量很低,推測可能是由于目的基

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