結(jié)腸癌細(xì)胞OXA耐藥相關(guān)microRNA篩選及機(jī)制研究.pdf

1、目的:研究微小RNA(microRNA，miRNA)在結(jié)腸癌細(xì)胞奧沙利鉑(Oxaliplatin，OXA)耐藥中發(fā)揮作用的分子機(jī)制，尋找與耐藥相關(guān)的調(diào)控性分子，為制定有效的逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥方法奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.采用梯度誘導(dǎo)法建立OXA耐藥的結(jié)腸癌細(xì)胞。
　　 2.利用miRNA芯片技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)技術(shù)檢測(cè)在耐藥的結(jié)腸癌細(xì)胞中差異性表達(dá)明顯的miRNA。

2、>　　 3.選取在耐藥細(xì)胞中低表達(dá)的miRNA-137作為研究對(duì)象，應(yīng)用MTT方法驗(yàn)證miRNA-137對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480和HCT-15耐藥的影響。
　　 4.利用生物信息學(xué)方法篩選miRNA-137的候選靶基因YBX1，采用熒光報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miRNA-137對(duì)靶基因的直接調(diào)控作用。采用Real-time PCR和Westernblot實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)miRNA-137功能增強(qiáng)的結(jié)腸癌細(xì)胞中靶基因YBX1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平

3、和蛋白水平表達(dá)，驗(yàn)證miRNA-137對(duì)靶基因的調(diào)控作用。用RNA干擾技術(shù)沉默該靶基因后，檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)OXA的敏感性。
　　 5.通過熒光定量PCR和免疫組化實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證臨床結(jié)腸癌標(biāo)本OXA耐藥性與hsa-miR-137和YBX1的表達(dá)之間的關(guān)系。
　　 結(jié)果:
　　 1.利用濃度為0.2～2.0μM的OXA建立了OXA耐藥的結(jié)腸癌細(xì)胞。
　　 2.hsa-miR-93、hsa-miR-191、hs

4、a-miR-137、hsa-miR-491-3p、hsa-miR-96、hsa-miR-21、hsa-miR-22、hsa-miR-192在人結(jié)腸癌親代細(xì)胞SW480和HCT-15與耐藥細(xì)胞SW480/OXA和HCT-15/OXA之間存在明顯差異性表達(dá)，在結(jié)腸癌細(xì)胞中進(jìn)行MTT試驗(yàn)，結(jié)果顯示:miR-93、miR-137、miR-21可調(diào)節(jié)OXA對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的殺傷功能。
　　 3.熒光報(bào)告載體試驗(yàn)中miRNA-137能夠通過作用

5、于YBX1基因的3'非翻譯區(qū)并對(duì)其表達(dá)進(jìn)行負(fù)性調(diào)節(jié)。在miRNA-137表達(dá)減弱的結(jié)腸癌細(xì)胞中，YBX1基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平都有明顯升高。
　　 4.在人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480和HCT-15中，沉默YBX1后細(xì)胞對(duì)OXA和順鉑(CDDP)的耐藥性明顯減弱。
　　 5.Real-time PCR結(jié)果顯示miR-137的轉(zhuǎn)錄水平與結(jié)腸癌組織的耐藥性呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì)。Western blot(WB)和免疫組化顯示YB