熱CO-,2-氣腹對結(jié)腸癌細胞的作用及作用機制研究.pdf

1、研究背景與目的： 結(jié)腸癌腹膜轉(zhuǎn)移是結(jié)腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的常見因素，嚴(yán)重影響患者的生存。長期以來腹膜種植轉(zhuǎn)移一直缺乏令人滿意的處理方法，全身化療雖傳統(tǒng)使用但不能改善患者生存，腹腔熱灌注化療雖可顯著改善患者生存，但術(shù)后并發(fā)癥及死亡率過高，應(yīng)用范圍有限。 本研究探討一種處理腹膜轉(zhuǎn)移的新方法-熱CO2氣腹(HT-CO2)。該方法通過加熱腹腔鏡手術(shù)中應(yīng)用的CO2氣腹至熱療作用溫度，形成熱CO2氣腹(42-44℃)，在術(shù)中及術(shù)后注入腹

2、腔，對腹膜轉(zhuǎn)移灶以及術(shù)中脫落腫瘤細胞組織進行殺傷，以期起到治療和預(yù)防腹膜轉(zhuǎn)移的作用。本研究首先通過建立體外熱CO2氣腹實驗?zāi)Ｐ吞接憻酑O2氣腹(42-44℃)對結(jié)腸癌細胞的殺傷、增殖抑制作用及其作用機制，進而在明確熱CO2氣腹體外作用的基礎(chǔ)上進一步建立體內(nèi)熱CO2氣腹實驗?zāi)Ｐ?，在動物體內(nèi)探討熱CO2氣腹的體內(nèi)作用安全性，最終從體外研究及初步的體內(nèi)研究探討了其作為一種新的腹膜轉(zhuǎn)移的治療方法的可能性。 材料與方法： 首先建立

3、體外熱CO2氣腹實驗?zāi)Ｐ?，熱CO2氣腹(42℃、43℃或44℃，3小時)作用七株人結(jié)腸癌細胞(SW480，LoVo，SW1116，HCT116，Caco-2，HT-29，COLO205)，WST-8法及光鏡觀察檢測細胞殺傷和細胞增殖抑制作用。進而通過熱CO2氣腹對COLO205細胞的作用系統(tǒng)深入地探討不同作用溫度和作用時間(42-44℃，2-4小時)的熱CO2氣腹的殺傷、增殖抑作用，并明確其作用機制。WST-8法檢測不同作用溫度和作用時

4、間熱CO2氣腹對COLO205的殺傷、增殖抑制作用，流式細胞術(shù)檢測及形態(tài)學(xué)觀察(Hoechst33342/PI熒光顯微鏡及透射電鏡)明確細胞死亡機制；Westernblot檢測凋亡相關(guān)蛋白，Rhodamine123流式細胞術(shù)檢測線粒體膜電位改變，熒光定量PCR檢測凋亡相關(guān)基因等進一步明確細胞凋亡的分子機制。流式細胞術(shù)檢測熱CO2氣腹作用后細胞周期改變，明確細胞周期阻滯及細胞增殖抑制的可能機制。溫度探頭及pH計檢測熱CO2氣腹作用后細胞外

5、環(huán)境溫度和pH改變，HEPES(羥乙基哌嗪乙磺酸)細胞外酸化抑制試驗明確熱CO2氣腹的作用因素。在體外研究基礎(chǔ)上，建立大鼠熱CO2氣腹體內(nèi)實驗?zāi)Ｐ停^察大鼠熱CO2氣腹處理對心肺功能、體核溫度的影響及腹膜損傷程度(熱CO2氣腹處理后6、24和96小時腹膜光鏡和掃描電鏡形態(tài)學(xué)觀察以及處理后2周腹腔粘連評估)，初步明確熱CO2氣腹在體內(nèi)的作用安全性。 結(jié)果： 熱CO2氣腹對七株結(jié)腸癌細胞的殺傷和增殖抑制作用不一。對于COLO

6、205細胞，42℃熱CO2氣腹作用3小時即有顯著的細胞殺傷和細胞增殖抑制作用(P＜0.01)，HCT116細胞則需要43℃作用3小時(P=0.01)，而SW480、Caco-2和HT-29則需要44℃作用3小時，LoVo和SW1116細胞則即使44℃的熱CO2氣腹作用3小時也無顯著殺傷和細胞增殖抑制作用?；贑OLO205細胞的進一步研究顯示熱CO2氣腹在42℃作用3h時即有顯著的殺傷作用(42℃作用3h，P=0.031；42℃作用3h

7、以上，P＜0.01)，44℃作用4小時后細胞存活率降低至49.5±5.5％。Annexin-V/PI流式細胞術(shù)及形態(tài)學(xué)(透射電鏡及Hochest33342/PI染色熒光顯微鏡)分析表明細胞凋亡是熱CO2氣腹作用后細胞死亡的主要方式。熱CO2氣腹誘導(dǎo)細胞凋亡呈劑量依賴性，凋亡比例隨作用溫度和時間的增加而不斷增加，44℃作用4小時后12小時的凋亡檢測表明凋亡率達52.63±4.62％(P＜0.001)。熱CO2氣腹誘導(dǎo)凋亡在不同作用溫度和時

8、間時細胞凋亡速度不一，高溫度長時間熱CO2氣腹作用能更快地誘導(dǎo)細胞凋亡，表現(xiàn)在高溫度更長時間作用時，早期凋亡比例下降而中晚期凋亡和壞死比例增加。形態(tài)學(xué)觀察(透射電鏡及Hoechst33342/PI雙染熒光顯微鏡)顯示典型的細胞凋亡改變。對細胞凋亡機制的進一步研究(線粒體膜電位檢測及WesternBlot對凋亡相關(guān)蛋白的檢測等)顯示Bax相關(guān)的線粒體途徑在熱CO2氣腹誘導(dǎo)細胞凋亡中起著重要作用。流式細胞術(shù)(Rhodamine-123染色)

9、線粒體膜電位檢測顯示熱CO2氣腹處理后線粒體膜電位顯著耗散。Westernblot分析表明熱CO2氣腹處理后細胞色素C自線粒體釋放入胞漿，caspase9被激活，并繼而激活下游caspase3，對線粒體途徑相關(guān)的上游蛋白Bcl-2家族蛋白和p53蛋白分析顯示Bax蛋白表達增加，而Bak，Bcl-2，Bcl-xL，和p53則未見表達改變。受體途徑的相關(guān)蛋白caspase8未見激活。熒光定量PCR對Bax基因表達的分析顯示Bax基因表達并未

10、增加。熱CO2氣腹處理后細胞外環(huán)境的檢測表明熱CO2氣腹作用后約30min細胞外環(huán)境溫度上升至與熱CO2氣腹相同的溫度，細胞外pH值在10min內(nèi)從7.4降低至6.7，HEPES抑制細胞外酸化可顯著抑制細胞殺傷。對熱CO2氣腹作用后細胞的流式細胞術(shù)細胞周期分析顯示熱CO2氣腹處理后G0/G1期細胞比率明顯增加，而S期和G2/M期細胞比率減少，48小時阻滯作用最為顯著，至72小時細胞阻滯開始緩解?；诖笫蟮捏w內(nèi)實驗顯示熱CO2氣腹對大鼠心

11、肺功能的影響與常規(guī)CO2氣腹相比無顯著差異，熱CO2氣腹作用后體核溫度顯著增高，與作用溫度和作用時間呈劑量依賴關(guān)系，增高幅度從最低的1.2±0.3℃(43℃作用2小時)到最高的1.7±0.3℃(44℃作用4小時)不等。腹膜形態(tài)學(xué)觀察(光鏡及掃描電鏡)顯示熱CO2氣腹作用后腹膜形態(tài)顯著改變。作用后6小時可見腹膜表面的系膜細胞顯著改變(細胞表面微絨毛數(shù)量減少、塌陷、縮短、消失，細胞間隙增寬，系膜細胞脫落，基底膜暴露等)。隨著作用溫度及時間的

12、增加損傷嚴(yán)重性增加，在高溫度長時間作用后系膜細胞脫落面積在50％以上。作用后24小時可見炎癥細胞粘附浸潤腹膜表面，熱CO2氣腹作用后96小時，在低溫度短時間的熱CO2氣腹作用組，全部或絕大多數(shù)的腹膜都恢復(fù)正常，但是在高溫度長時間熱CO2氣腹作用組(44℃作用3、4小時)，由于損傷較重，細胞脫落面積大，96小時后仍有相當(dāng)?shù)膮^(qū)域不能恢復(fù)，腹膜僅為增厚的結(jié)締組織。2周后腹腔粘連評估顯示熱CO2氣腹作用后增加腹腔粘連(43℃作用2小時和44℃作

13、用4小時各有一例粘連)。 結(jié)論： 一定劑量水平的熱CO2氣腹對多數(shù)結(jié)腸癌細胞株有殺傷作用和細胞增殖抑制作用，但是不同結(jié)腸癌細胞株對于熱CO2氣腹的敏感性不一，某些細胞株對熱CO2氣腹敏感，而有些細胞株則相對耐受?；诮Y(jié)腸癌細胞株COLO205細胞的研究提示熱CO2氣腹殺傷作用與熱CO2氣腹的熱作用及降低細胞外pH酸化細胞外環(huán)境有關(guān)，熱CO2氣腹誘導(dǎo)Bax相關(guān)的線粒體機制的細胞凋亡是其殺傷作用的主要細胞分子作用機制。熱CO