下調(diào)GPI對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡、遷移的影響及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、結(jié)腸癌是胃腸道常見的惡性腫瘤，作為第三大常見腫瘤，每年大概有超過一百萬的患者被確診為結(jié)腸癌。近年來，結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率逐年遞增，在我國表現(xiàn)尤為突出，達(dá)到甚至超過了西方國家水平；我國結(jié)腸癌的高發(fā)年齡為50-60歲，比西方國家早10歲[1]。即便近年來結(jié)腸癌的診斷和治療取得了飛躍性的進(jìn)展，但是其具體的病理機(jī)制仍然不太清楚。所以，深入研究結(jié)腸癌發(fā)病的分子機(jī)制和細(xì)胞機(jī)制，為結(jié)腸癌的早期診斷和靶向治療提供理論依據(jù)和線索很有必要。
　　磷

2、酸葡萄糖異構(gòu)酶（Glucose phosphate isomerase，GPI）廣泛分布于人體各組織中，是細(xì)胞內(nèi)糖酵解和糖異生過程中的關(guān)鍵酶，可促進(jìn)6-磷酸葡萄糖（glucose-6-phosphate）和6-磷酸果糖（fructose-6-phosphate）相互轉(zhuǎn)換。當(dāng)GPI被分泌到胞外，作為自分泌活動(dòng)因子（autocrine motility factors，AMF），以自分泌的形式與細(xì)胞自身或鄰近細(xì)胞表面受體（autocrine

3、 motility factor receptor，AMFR）相結(jié)合影響細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移等。研究表明，GPI/AMF在乳腺癌，腎癌，肺癌，子宮內(nèi)膜瘤，骨肉瘤，胃腸道腫瘤等多種腫瘤中呈高表達(dá)狀態(tài)[2-6]，在結(jié)腸癌患者的尿液和血清中，GPI/AMF的水平較正常人升高[7]。大量文獻(xiàn)報(bào)道，GPI不僅與腫瘤的發(fā)生和分級(jí)密切相關(guān)，還能影響腫瘤細(xì)胞的凋亡、遷移及浸潤等[6,8-10]。
　　水通道蛋白（Aquaporins，AQPs）

4、家族成員與腫瘤的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)，Chulso Moon等人報(bào)道AQP1、AQP3、AQP5在HCT-116、HT-20、SW480等7種結(jié)腸癌細(xì)胞中表達(dá)[11]。其中，AQP3在呼吸系統(tǒng)（氣道、肺等）、消化系統(tǒng)（胃、結(jié)腸）、泌尿系統(tǒng)、感覺器官（眼、淚腺）中均有表達(dá)。AQP3的激活可以使某些腫瘤細(xì)胞遷移能力變強(qiáng)（如胰腺癌細(xì)胞株MPC-83）。在結(jié)腸癌中，癌組織AQP3的表達(dá)也明顯高于癌旁組織。AQP3在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織的分化程度和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)

5、移中發(fā)揮了重要作用。眾所周知，PI3K/AKT信號(hào)通路普遍存在于各種細(xì)胞中，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在結(jié)腸癌中，PI3K/AKT信號(hào)通路的反常激活[12]，能夠調(diào)控下游基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix Metalloproteinases，MMPs）等基因，從而影響腫瘤細(xì)胞的浸潤、遷移等過程[13-14]。研究還發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT信號(hào)通路在hEGF誘導(dǎo)AQP3表達(dá)中也扮演了重要角色[15]。
　　因此，我們設(shè)想下調(diào)GPI/AMF是

6、否能影響結(jié)腸癌細(xì)胞 HCT-116的凋亡和遷移？人結(jié)腸癌 HCT-116細(xì)胞的遷移是否與AQP3相關(guān)PI3K/AKT信號(hào)通路在此過程中是否起到至關(guān)重要的作用？
　　目的：
　　本文以人結(jié)腸癌細(xì)胞株為研究對(duì)象，篩選出GPI高表達(dá)細(xì)胞株。嘗試探索GPI對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，遷移，浸潤及AQP3表達(dá)水平的影響，并探討其對(duì)遷移及浸潤影響的可能機(jī)制，為靶向 GPI治療結(jié)腸癌提供研究線索和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　運(yùn)用RT-P

7、CR和Western-blot分別檢測常規(guī)培養(yǎng)的人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29、HCT-116、SW480及caco2中GPI的mRNA和蛋白表達(dá)情況，篩選GPI高表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞株；CCK-8法確定篩選GPI穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HCT-116細(xì)胞株的嘌磷霉素濃度；慢病毒質(zhì)粒感染構(gòu)建干擾 GPI的HCT-116細(xì)胞，嘌磷霉素篩選穩(wěn)定感染細(xì)胞株后，于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率；Western-blot和RT-PCR法檢測感染前后GPI表達(dá)水平；采用FCM（F

8、low cytometry）法檢測干擾GPI前后HCT-116細(xì)胞株的周期和凋亡情況；劃痕實(shí)驗(yàn)檢測干擾GPI對(duì)HCT-116細(xì)胞遷移的影響；Transwell檢測干擾GPI對(duì)HCT-116細(xì)胞遷移及浸潤的影響；Western-blot檢測細(xì)胞周期調(diào)控蛋白Cyclin D1，促凋亡蛋白Bax，抗凋亡蛋白Bcl-2，抑癌蛋白p53和激活型caspase3，遷移相關(guān)蛋白基質(zhì)金屬酶MMP3、MMP9，水通道蛋白AQP3，PI3K/AKT信號(hào)通路

9、蛋白PI3K、AKT、p-AKT的表達(dá)。通過分別設(shè)立PI3K/AKT特異性抑制劑LY294002，干擾GPI單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用來探究GPI/AMF，PI3K/AKT信號(hào)通路與MMP3、MMP9、AQP3之間的上下游關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1. RT-PCR和Western-blot結(jié)果顯示：HT-29、HCT-116、SW480、caco2四株結(jié)腸癌細(xì)胞株中，GPI的 mRNA和蛋白表達(dá)量最高的是HCT-116細(xì)胞，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選

10、用HCT-116細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。
　　2.CCK-8結(jié)果顯示：0.8μg/mL的嘌磷霉素，對(duì)HCT-116細(xì)胞的抑制率接近95%。故選用0.8μg/mL的嘌磷霉素進(jìn)行干擾GPI穩(wěn)定感染株的篩選。
　　3.成功構(gòu)建干擾GPI的慢病毒質(zhì)粒，HCT-116細(xì)胞感染重組質(zhì)粒后，嘌磷霉素篩選，于熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)siGPI組的細(xì)胞幾乎全被慢病毒感染；siGPI組GPI基因的mRNA及蛋白表達(dá)水平下調(diào)。RT-PCR結(jié)果顯示，與par

11、ental組比較，siGPI組細(xì)胞的GPI mRNA的抑制率為30.0%，有顯著性差異（P＜0.05），mock組與parental組相較無明顯差異（P＞0.05）；Western-blot結(jié)果顯示：與parental組比較，siGPI組細(xì)胞GPI蛋白抑制率為55.0%，有顯著性差異（P＜0.05），mock組與parenta組相較無明顯差異（P＞0.05）。
　　4.FCM檢測細(xì)胞周期：siGPI組細(xì)胞G0/G1期所占比例（65

12、.81±2.16）%明顯高于與 parental組（58.07±1.69）%（P＜0.05），mock組（59.03±2.76）%與parental組比較無顯著性差異（P＞0.05）；與parental組相較，siGPI組的G2/M期和S期的細(xì)胞占比數(shù)量明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　5.FCM檢測細(xì)胞凋亡：siGPI組細(xì)胞凋亡率（24.74±4.75）%明顯高于parental組（8.48±1.97）%（P＜

13、0.05），mock組（9.67±1.71）%與parental比較無顯著性差異（P＞0.05）。
　　6.Western-blot檢測周期蛋白及凋亡蛋白：與parental組比較，siGPI組細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1和凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)下調(diào)，抑癌蛋白p53、促凋亡蛋白Bax和Cleaved-caspase3的表達(dá)上調(diào)，且均有顯著性差異（P＜0.05），mock組與parental組比較無顯著性差異。
　　7

14、.劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與parental組比較，siGPI組細(xì)胞遷移速度減慢，mock組與parental組比較，細(xì)胞遷移速度無明顯差別；干擾GPI、LY294002單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用均會(huì)使得細(xì)胞遷移速度變慢。特別是當(dāng)干擾GPI和LY294002聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，細(xì)胞遷移速度變得更為緩慢。
　　8.Transwell結(jié)果顯示：與parental組比較，siGPI組的穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，mock組與parental組相較，穿膜的細(xì)胞數(shù)量無明顯變

15、化；干擾GPI、LY294002單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用均會(huì)使得穿膜細(xì)胞數(shù)量減少。特別是當(dāng)干擾GPI和LY29002聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，穿膜細(xì)胞的數(shù)量減少的更為明顯。
　　9.Western-blot檢測遷移相關(guān)蛋白及PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白：與parental組比較，siGPI組細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白MMP3、MMP9、水通道蛋白AQP3、PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白PI3K、p-AKT的蛋白水平均明顯下調(diào)（P＜0.05），AKT蛋白表達(dá)量無明

16、顯變化。
　　10.Western-blot檢測LY294002和GPI siRNA單獨(dú)或聯(lián)合誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞后相關(guān)蛋白表達(dá)情況：LY294002可以抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的激活，同時(shí)下調(diào)MMP3、MMP9、AQP3蛋白的表達(dá)，但對(duì)GPI蛋白的表達(dá)沒有明顯影響。與LY294002單獨(dú)處理結(jié)腸癌細(xì)胞比較，干擾GPI和LY294002聯(lián)合處理細(xì)胞時(shí)，GPI、MMP3、MMP9、AQP3、PI3K、p-AKT蛋白水平明顯降低（P＜0

17、.05），AKT蛋白量無明顯變化；與siGPI比較，干擾GPI和LY294002聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，MMP3、MMP9、AQP3、PI3K、p-AKT蛋白水平均顯著下降（P＜0.05），GPI、AKT蛋白表達(dá)量無明顯變化。
　　結(jié)論：
　　1.下調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞GPI后，細(xì)胞周期被阻滯于G0/G1期，并能誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。其可能的機(jī)制是通過激活p53信號(hào)通路，抑制周期蛋白Cyclin D1的表達(dá)，同時(shí)擾亂Bcl-2/Bax比例，激活c