下調(diào)GPI對人結腸癌細胞凋亡、遷移的影響及相關機制研究.pdf

1、結腸癌是胃腸道常見的惡性腫瘤，作為第三大常見腫瘤，每年大概有超過一百萬的患者被確診為結腸癌。近年來，結腸癌的發(fā)病率和死亡率逐年遞增，在我國表現(xiàn)尤為突出，達到甚至超過了西方國家水平；我國結腸癌的高發(fā)年齡為50-60歲，比西方國家早10歲[1]。即便近年來結腸癌的診斷和治療取得了飛躍性的進展，但是其具體的病理機制仍然不太清楚。所以，深入研究結腸癌發(fā)病的分子機制和細胞機制，為結腸癌的早期診斷和靶向治療提供理論依據(jù)和線索很有必要。
　　磷

2、酸葡萄糖異構酶（Glucose phosphate isomerase，GPI）廣泛分布于人體各組織中，是細胞內(nèi)糖酵解和糖異生過程中的關鍵酶，可促進6-磷酸葡萄糖（glucose-6-phosphate）和6-磷酸果糖（fructose-6-phosphate）相互轉換。當GPI被分泌到胞外，作為自分泌活動因子（autocrine motility factors，AMF），以自分泌的形式與細胞自身或鄰近細胞表面受體（autocrine

3、 motility factor receptor，AMFR）相結合影響細胞的增殖、凋亡、遷移等。研究表明，GPI/AMF在乳腺癌，腎癌，肺癌，子宮內(nèi)膜瘤，骨肉瘤，胃腸道腫瘤等多種腫瘤中呈高表達狀態(tài)[2-6]，在結腸癌患者的尿液和血清中，GPI/AMF的水平較正常人升高[7]。大量文獻報道，GPI不僅與腫瘤的發(fā)生和分級密切相關，還能影響腫瘤細胞的凋亡、遷移及浸潤等[6,8-10]。
　　水通道蛋白（Aquaporins，AQPs）

4、家族成員與腫瘤的發(fā)生發(fā)展息息相關，Chulso Moon等人報道AQP1、AQP3、AQP5在HCT-116、HT-20、SW480等7種結腸癌細胞中表達[11]。其中，AQP3在呼吸系統(tǒng)（氣道、肺等）、消化系統(tǒng)（胃、結腸）、泌尿系統(tǒng)、感覺器官（眼、淚腺）中均有表達。AQP3的激活可以使某些腫瘤細胞遷移能力變強（如胰腺癌細胞株MPC-83）。在結腸癌中，癌組織AQP3的表達也明顯高于癌旁組織。AQP3在淋巴結轉移、組織的分化程度和遠處轉

5、移中發(fā)揮了重要作用。眾所周知，PI3K/AKT信號通路普遍存在于各種細胞中，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。在結腸癌中，PI3K/AKT信號通路的反常激活[12]，能夠調(diào)控下游基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix Metalloproteinases，MMPs）等基因，從而影響腫瘤細胞的浸潤、遷移等過程[13-14]。研究還發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT信號通路在hEGF誘導AQP3表達中也扮演了重要角色[15]。
　　因此，我們設想下調(diào)GPI/AMF是

6、否能影響結腸癌細胞 HCT-116的凋亡和遷移？人結腸癌 HCT-116細胞的遷移是否與AQP3相關PI3K/AKT信號通路在此過程中是否起到至關重要的作用？
　　目的：
　　本文以人結腸癌細胞株為研究對象，篩選出GPI高表達細胞株。嘗試探索GPI對結腸癌細胞凋亡，遷移，浸潤及AQP3表達水平的影響，并探討其對遷移及浸潤影響的可能機制，為靶向 GPI治療結腸癌提供研究線索和實驗依據(jù)。
　　方法：
　　運用RT-P

7、CR和Western-blot分別檢測常規(guī)培養(yǎng)的人結腸癌細胞株HT-29、HCT-116、SW480及caco2中GPI的mRNA和蛋白表達情況，篩選GPI高表達的結腸癌細胞株；CCK-8法確定篩選GPI穩(wěn)定轉染HCT-116細胞株的嘌磷霉素濃度；慢病毒質(zhì)粒感染構建干擾 GPI的HCT-116細胞，嘌磷霉素篩選穩(wěn)定感染細胞株后，于熒光顯微鏡下觀察轉染效率；Western-blot和RT-PCR法檢測感染前后GPI表達水平；采用FCM（F

8、low cytometry）法檢測干擾GPI前后HCT-116細胞株的周期和凋亡情況；劃痕實驗檢測干擾GPI對HCT-116細胞遷移的影響；Transwell檢測干擾GPI對HCT-116細胞遷移及浸潤的影響；Western-blot檢測細胞周期調(diào)控蛋白Cyclin D1，促凋亡蛋白Bax，抗凋亡蛋白Bcl-2，抑癌蛋白p53和激活型caspase3，遷移相關蛋白基質(zhì)金屬酶MMP3、MMP9，水通道蛋白AQP3，PI3K/AKT信號通路

9、蛋白PI3K、AKT、p-AKT的表達。通過分別設立PI3K/AKT特異性抑制劑LY294002，干擾GPI單獨或聯(lián)合應用來探究GPI/AMF，PI3K/AKT信號通路與MMP3、MMP9、AQP3之間的上下游關系。
　　結果：
　　1. RT-PCR和Western-blot結果顯示：HT-29、HCT-116、SW480、caco2四株結腸癌細胞株中，GPI的 mRNA和蛋白表達量最高的是HCT-116細胞，故后續(xù)實驗選

10、用HCT-116細胞為實驗對象。
　　2.CCK-8結果顯示：0.8μg/mL的嘌磷霉素，對HCT-116細胞的抑制率接近95%。故選用0.8μg/mL的嘌磷霉素進行干擾GPI穩(wěn)定感染株的篩選。
　　3.成功構建干擾GPI的慢病毒質(zhì)粒，HCT-116細胞感染重組質(zhì)粒后，嘌磷霉素篩選，于熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)siGPI組的細胞幾乎全被慢病毒感染；siGPI組GPI基因的mRNA及蛋白表達水平下調(diào)。RT-PCR結果顯示，與par

11、ental組比較，siGPI組細胞的GPI mRNA的抑制率為30.0%，有顯著性差異（P＜0.05），mock組與parental組相較無明顯差異（P＞0.05）；Western-blot結果顯示：與parental組比較，siGPI組細胞GPI蛋白抑制率為55.0%，有顯著性差異（P＜0.05），mock組與parenta組相較無明顯差異（P＞0.05）。
　　4.FCM檢測細胞周期：siGPI組細胞G0/G1期所占比例（65

12、.81±2.16）%明顯高于與 parental組（58.07±1.69）%（P＜0.05），mock組（59.03±2.76）%與parental組比較無顯著性差異（P＞0.05）；與parental組相較，siGPI組的G2/M期和S期的細胞占比數(shù)量明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　5.FCM檢測細胞凋亡：siGPI組細胞凋亡率（24.74±4.75）%明顯高于parental組（8.48±1.97）%（P＜

13、0.05），mock組（9.67±1.71）%與parental比較無顯著性差異（P＞0.05）。
　　6.Western-blot檢測周期蛋白及凋亡蛋白：與parental組比較，siGPI組細胞周期蛋白Cyclin D1和凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達下調(diào)，抑癌蛋白p53、促凋亡蛋白Bax和Cleaved-caspase3的表達上調(diào)，且均有顯著性差異（P＜0.05），mock組與parental組比較無顯著性差異。
　　7

14、.劃痕實驗結果顯示：與parental組比較，siGPI組細胞遷移速度減慢，mock組與parental組比較，細胞遷移速度無明顯差別；干擾GPI、LY294002單獨或聯(lián)合應用均會使得細胞遷移速度變慢。特別是當干擾GPI和LY294002聯(lián)合應用時，細胞遷移速度變得更為緩慢。
　　8.Transwell結果顯示：與parental組比較，siGPI組的穿膜細胞數(shù)明顯減少，mock組與parental組相較，穿膜的細胞數(shù)量無明顯變

15、化；干擾GPI、LY294002單獨或聯(lián)合應用均會使得穿膜細胞數(shù)量減少。特別是當干擾GPI和LY29002聯(lián)合應用時，穿膜細胞的數(shù)量減少的更為明顯。
　　9.Western-blot檢測遷移相關蛋白及PI3K/AKT信號通路相關蛋白：與parental組比較，siGPI組細胞遷移相關蛋白MMP3、MMP9、水通道蛋白AQP3、PI3K/AKT信號通路蛋白PI3K、p-AKT的蛋白水平均明顯下調(diào)（P＜0.05），AKT蛋白表達量無明

16、顯變化。
　　10.Western-blot檢測LY294002和GPI siRNA單獨或聯(lián)合誘導結腸癌細胞后相關蛋白表達情況：LY294002可以抑制PI3K/AKT信號通路的激活，同時下調(diào)MMP3、MMP9、AQP3蛋白的表達，但對GPI蛋白的表達沒有明顯影響。與LY294002單獨處理結腸癌細胞比較，干擾GPI和LY294002聯(lián)合處理細胞時，GPI、MMP3、MMP9、AQP3、PI3K、p-AKT蛋白水平明顯降低（P＜0

17、.05），AKT蛋白量無明顯變化；與siGPI比較，干擾GPI和LY294002聯(lián)合應用時，MMP3、MMP9、AQP3、PI3K、p-AKT蛋白水平均顯著下降（P＜0.05），GPI、AKT蛋白表達量無明顯變化。
　　結論：
　　1.下調(diào)結腸癌細胞GPI后，細胞周期被阻滯于G0/G1期，并能誘導結腸癌細胞凋亡。其可能的機制是通過激活p53信號通路，抑制周期蛋白Cyclin D1的表達，同時擾亂Bcl-2/Bax比例，激活c