當歸補血湯調(diào)控紅系祖細胞分化的機制.pdf

1、背景和目的：
　　臨床治療紅細胞減少可以通過紅細胞回輸?shù)姆椒▉砘謴脱褐屑t細胞的數(shù)量，但伴有病毒和細菌感染的危險;可以通過靜脈補鐵來治療與缺鐵相關(guān)的貧血，但可能會引起惡心、面部潮紅、低血壓和過敏反應等副作用，嚴重的會導致死亡;也可以通過促紅細胞生成素(EPO)來促進機體自身紅細胞的生成，但是多達10％的貧血病人會因體內(nèi)產(chǎn)生EPO中和抗體或其它原因而導致治療失敗。EPO作為控制體內(nèi)紅細胞水平的主要細胞因子只是在CFU-E祖細胞分化為

2、成熟紅細胞的前期階段起調(diào)控作用，而且體內(nèi)CFU-E祖細胞的數(shù)量限制了EPO促進紅細胞生成的能力。因此單純利用EPO治療紅細胞減少，只能調(diào)控紅細胞生成的某一環(huán)節(jié)，不能從根本上對紅細胞的生成進行有效調(diào)控，同時CFU-E的消耗也會導致BFU-E祖細胞的消耗，從而導致BFU-E祖細胞庫的衰竭，繼而影響機體的后續(xù)造血，已有文獻報道用EPO治療后會導致嚴重的純紅細胞再生障礙。因此開發(fā)給藥方便的、多靶點整體調(diào)節(jié)的，同時又安全有效的促紅細胞生成藥物是有

3、必要的。
　　本項目研究的中藥組方當歸補血湯，出自金元四大家之一李杲的《內(nèi)外傷辨惑論》卷中，方劑組成為黃芪一兩，當歸兩錢，具有補氣生血之功效，主治勞倦內(nèi)傷，氣血虛弱，陽浮于外，肌膚燥熱，面紅目赤，煩渴引飲，脈洪大而虛，以及婦人經(jīng)行、產(chǎn)后血虛發(fā)熱頭痛，或瘡瘍潰后久不愈合者。已有800多年的應用歷史，臨床療效顯著，特別是對放化療引起的骨髓抑制有很好的緩解作用。已有文獻報道，當歸補血湯能夠升高外周血中紅細胞和骨髓組織中BFU-E和CFU

4、-E祖細胞的數(shù)量。
　　內(nèi)容和結(jié)論：
　　第一部分當歸補血湯質(zhì)控方法建立
　　1、當歸補血湯HPLC色譜條件優(yōu)化
　　2、當歸補血湯HPLC色譜條件方法學驗證
　　3、當歸補血湯中阿魏酸和芒柄花素含量測定
　　4、當歸補血湯共有指紋圖譜和共有峰研究
　　主要結(jié)論:
　　不同溶劑溶解樣品所得色譜峰的數(shù)目和分離度不同，95％甲醇用來溶解樣品時，所得色譜峰的數(shù)目多于其它兩種，色譜峰的總峰面積也最

5、高，但通過分析色譜峰的峰形發(fā)現(xiàn)，親水區(qū)95％甲醇所獲得峰形都比較寬、平且伴有肩峰，峰的對稱性和分離度相比另外兩種較差，疏水區(qū)5％和50％甲醇所獲得峰的峰高低于95％，其中5％所獲得峰數(shù)目較少，峰的峰高較50％和95％低很多，有可能影響峰的檢出。建立色譜條件的目的是使更多的化合物能夠被檢出，因此選擇50％甲醇作為溶解樣品的溶劑。
　　色譜柱對中藥組分的分離有影響，其中Agilent TC-C18色譜柱所得色譜圖對應色譜峰的保留時間較

6、另外兩種色譜柱時間延后，并且親水性藥物組分的分離效果顯著好于其它兩種色譜柱。疏水性藥物組分的分離效果三種色譜柱都能做到基線分離。綜合以上分析，Agilent TC-C18色譜柱的分離效果最好。
　　不同流動相的分離能力也有所不同，乙腈洗脫能力強于甲醇，色譜峰出峰時間較快，保留時間較短。甲醇乙酸洗脫系統(tǒng)與其它三種洗脫系統(tǒng)相比色譜圖Ⅱ區(qū)峰數(shù)量較多，分離度較高，峰的對稱性較好;Ⅲ區(qū)色譜峰乙腈洗脫系統(tǒng)的分離效果較甲醇系統(tǒng)好，但從峰的數(shù)目和

7、能否做到基線分離來看，甲醇系統(tǒng)也可以做到基線分離，只是分離度沒有乙腈系統(tǒng)高。綜合以上分析，我們選擇甲醇乙酸系統(tǒng)作為進一步優(yōu)化的流動相。
　　由于流動相洗脫能力的不同，不同分析物解吸附的時間就有所不同，從而導致峰與峰之間分離度不同。因此我們根據(jù)不同階段峰分離度的不同，采取了不同梯度的洗脫方法來達到最佳的分離效果。最終通過實驗取得了良好的色譜峰分離度和基線分離。
　　為了達到控制產(chǎn)品質(zhì)量的目的，所采取的分析方法必須具有很高的準確

8、性和可靠性，因此需要對所采取方法進行方法學驗證。穩(wěn)定性試驗表明不同時間點所得色譜指紋圖譜與其所得共有模式圖譜的相似度，均大于0.950，各色譜峰保留時間的RSD均小于0.3％，相對峰高比值的RSD除6和11號峰外（6號6.42％，11號5.09％）均小于5％，說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定;精密度試驗表明6次所得色譜指紋圖譜與其所得共有模式圖譜的相似度，均大于0.950，各色譜峰保留時間的RSD均小于0.8％，相對峰高比值的RSD均小于

9、5％，結(jié)果表明精密度良好;重復性試驗表明6份供試品所得指紋圖譜與其所得共有模式圖譜的相似度，均大于0.99，各色譜峰保留時間的RSD均小于1.5‰相對峰高比值的RSD均小于5％，結(jié)果表明重復性良好。
　　通過比較6批當歸補血湯的指紋圖譜，共篩選出17個共有峰，共有峰的保留時間RSD均小于0.1％，因此標定此17個峰為共有指紋峰。
　　第二部分當歸補血湯調(diào)控紅系祖細胞分化機制
　　1、當歸補血湯小鼠體內(nèi)促紅細胞生成能力及

10、作用靶點研究
　　2、體外細胞模型建立
　　3、當歸補血湯促骨髓基質(zhì)細胞數(shù)目增加機制
　　4、當歸補血湯體外促紅系祖細胞分化機制
　　主要結(jié)論:
　　當歸補血湯小鼠體內(nèi)能夠促進紅細胞生成。單因素方差分析結(jié)果表明各組間紅細胞、網(wǎng)織紅細胞和白細胞數(shù)目差異具有統(tǒng)計學意義(F=7.608，P＜0.001;F=6.391，P=0.001;F=3.067，P=0.028)，LSD多重比較表明，當歸補血湯高劑量組與模型組

11、相比外周血中網(wǎng)織紅細胞的數(shù)目顯著升高(P＜0.05)，當歸補血湯組外周血中紅細胞數(shù)目與模型組相比無顯著性差異。因此得出結(jié)論，當歸補血湯在小鼠體內(nèi)能夠促進網(wǎng)織紅細胞的生成，但對外周血中紅細胞的數(shù)目影響不大，這可能與外周血中成熟紅細胞的生命周期有關(guān)。
　　集落形成單位培養(yǎng)實驗單因素方差分析結(jié)果表明各組間CFU-E和BFU-E克隆數(shù)目差異具有統(tǒng)計學意義(F=10.119，P＜0.001;F=9.346，P＜0.001)，LSD多重比較表

12、明當歸補血湯中劑量組和高劑量組骨髓中晚期紅系祖細胞的數(shù)目與模型組相比顯著升高(P＜0.01)，當歸補血湯中劑量組和高劑量組骨髓中早期紅系祖細胞的數(shù)目與模型組相比顯著升高(P＜0.01)。流式結(jié)果表明當歸補血湯中、高劑量組骨髓中紅系相關(guān)細胞百分比與模型組相比顯著性升高(P＜0.01)。以上結(jié)果表明，當歸補血湯可通過促進紅系祖細胞增殖和分化來促進紅細胞的生成。
　　取不同組骨髓細胞體外培養(yǎng)，以觀察骨髓基質(zhì)細胞的生長狀態(tài)。結(jié)果表明，第三

13、天時各組都有細胞開始貼壁生長，其中當歸補血湯低、中、高劑量組和正常組較為顯著，貼壁生長細胞約鋪滿96孔板底的四分之一，而骨髓抑制模型組貼壁細胞細胞數(shù)目較少;第六天時當歸補血湯高劑量組貼壁細胞己鋪板板底的二分之一;培養(yǎng)第九天當歸補血湯高劑量組有明顯的成纖維細胞克隆形成。
　　細胞周期結(jié)果表明，當歸補血湯低、中和高劑量組G2M期細胞比例分別為8％、7.4％和7.6％，與模型組相比P＞0.05，無顯著差異。細胞黏附實驗表明，當歸補血湯中

14、劑量和高劑量組聚集細胞的數(shù)目與模型組相比顯著著升高，具有顯著差異(P＜0.05)。通過以上動物實驗結(jié)果，推測當歸補血湯調(diào)控紅系祖細胞分化為成熟紅細胞的途徑之一，可能是通過增加骨髓基質(zhì)細胞與紅系祖細胞之間的相互接觸，并傳遞促紅系祖細胞向成熟紅細胞分化的細胞信號來完成。
　　骨髓基質(zhì)細胞體外培養(yǎng)受到細胞接種密度和培養(yǎng)體系體積的影響。接種1×105個/孔的培養(yǎng)孔基本無骨髓基質(zhì)細胞生長，接種3×105個/孔細胞的骨髓基質(zhì)細胞貼壁約30％左

15、右，接種5×105個/孔細胞的基質(zhì)細胞貼壁達90％左右。3×105個/孔體系組，150μL和200μL培養(yǎng)體系孔骨髓基質(zhì)細胞的貼壁數(shù)目顯著低于100μL體系孔(P＜0.01)，而接種細胞數(shù)目為5×105個/孔時，各培養(yǎng)體系組骨髓基質(zhì)細胞貼壁數(shù)目無顯著差異。當細胞接種密度為3×105個/孔時，條件培養(yǎng)基組與普通培養(yǎng)基組相比能顯著促進骨髓基質(zhì)細胞的生長(P＜0.05)，而細胞接種數(shù)目為5×105個/孔時，條件培養(yǎng)基組細胞貼壁數(shù)目與普通培養(yǎng)基

16、組無顯著差異。結(jié)果提示我們條件培養(yǎng)基包含有促骨髓基質(zhì)細胞體外生長所必須的生長因子，因此骨髓基質(zhì)細胞在體外培養(yǎng)時自身會分泌胞外因子來促進自身的生長，并且當胞外因子的濃度達到一定濃度后促生長作用達到平臺，同時提示我們可以通過利用條件培養(yǎng)基來進行骨髓基質(zhì)細胞的體外低密度培養(yǎng)。
　　第三部分當歸補血湯調(diào)控紅系祖細胞分化的物質(zhì)基礎
　　1、不同批次當歸補血湯的藥效學作用
　　2、不同批次當歸補血湯藥效作用與指紋圖譜之間的譜效關(guān)系

17、
　　主要結(jié)論:
　　不同批次當歸補血湯促骨髓基質(zhì)細胞數(shù)目增加的能力有所不同，其中GG組當歸補血湯促骨髓基質(zhì)細胞數(shù)目增加的能力顯著強于其它組(P＜0.05)。通過直觀比較法和相關(guān)系數(shù)法探討當歸補血湯指紋圖譜與藥效學之間的譜效關(guān)系。通過比較GG組當歸補血湯指紋圖譜與其它組指紋圖譜的差異，尋找在GG組峰面積最高的特征峰作為當歸補血湯潛在的物質(zhì)基礎。又進一步通過統(tǒng)計軟件分析了各色譜峰峰面積與藥效之間的相關(guān)性，以尋找當歸補血湯發(fā)揮藥