MicroRNA-486在造血細胞紅系分化中的表達及機制研究.pdf

1、MicroRNA(miRNA)是一類由內源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子。miRNA主要在轉錄和轉錄后發(fā)揮對基因的調控作用,包括造血干細胞的自我更新和分化過程,但其在造血細胞分化的表達及其對分化的調控作用并不清楚。
　　MicroRNA-486(miR-486)首先在人胎肝組織中被鑒定,因為人胎肝組織是造血增殖分化最旺盛的組織之一,利用經(jīng)典方法從胎肝組織中鑒定的miRNA無疑是高豐度并可能參與造血生成過程調節(jié)

2、的重要miRNA。miR-486基因組學分析表明該基因(GeneID:619554)位于8號染色體Ankyrin-1(Ank-1)基因的第40個內含子(8p11.21位點)。Ank-1在肌肉組織、紅細胞及腦組織等組織中廣泛存在,但與造血干細胞調控的關系仍然不清楚。本論文將對miR-486在造血干細胞分化中的表達變化及調控機制進行闡述。
　　本課題首先利用實時定量PCR(real-timePCR)方法檢測了小鼠各臟器及血液中miR-

3、486的表達情況,結果發(fā)現(xiàn)miR-486在血液、肌肉和心肌中高表達,并且其在造血細胞中表達量最高。我們課題組前期研究工作基礎:在比較慢性粒細胞白血病(CML)和正常CD34+細胞MicroRNA表達譜時發(fā)現(xiàn)miR-486在CMLCD34+細胞高表達,進一步證明miR-486與CMLBCR-ABL融合基因的促紅系分化相關。第二,分離人臍帶血CD34+細胞,并在含有不同造血生長因子組合的培養(yǎng)體系中進行分化誘導并利用流式細胞儀檢測造血細胞分化

4、效率,同步利用RT-QPCR方法檢測miR-486的表達。結果發(fā)現(xiàn)隨著造血干細胞向紅系分化,miR-486表達水平隨之增高;第三,文獻調研顯示:GATA1是第一個被識別也是最重要的GATA家族因子,在紅系細胞中大量表達,同時也是在紅系分化和成熟過程中起關鍵作用的中心轉錄因子,許多具有紅系特異功能的基因均受GATA1的調控。我們通過慢病毒介導的GATA1沉默策略,沉默臍帶血CD34+細胞GATA1的表達,并同步檢測miR-486的表達水平

5、。結果發(fā)現(xiàn)GATA1的沉默效率可以達到82％,可以有效阻斷CD34+細胞向紅系分化,同時miR-486的表達水平也明顯降低。克隆形成實驗,第10天時計數(shù)紅系集落,對照組紅系集落數(shù)為54±4.89,GATA1沉默組紅系集落數(shù)為16±5,P<0.05,結果表明GATA1沉默抑制臍帶血CD34+細胞的紅系分化,與分化實驗結果相符。以上結果均證明了miR-486在造血干細胞紅系分化過程中起到重要的作用。
　　MicroRNA通過3’UTR

6、調控靶基因表達并發(fā)揮其生物學效應。單一MicroRNA可以調控多個靶基因的表達,而單一靶基因也可受到多個MicroRNA的調控。通過靶基因的分析可以預測MicroRNA的生物學功能。我們利用Targetscan6.2檢索發(fā)現(xiàn)miR-486存在多個預測靶基因,其中FOXO1,PTEN,ARID4B等與白血病發(fā)病密切相關。為此我們克隆了ARID4B基因的3′UTR并構建了PGL-3M熒光素酶報告載體,將報告載體和miR-486表達載體共轉染