高原習(xí)服及習(xí)服不良過程中基因表達(dá)特征及其病理生理學(xué)意義研究.pdf

1、目的:
　　基因表達(dá)變化是轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的核心內(nèi)容，細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組具有時空特異性，隨時間和空間的改變而改變，因此基因表達(dá)變化是細(xì)胞維持穩(wěn)態(tài)和改變自身狀態(tài)的主要途徑。對基因表達(dá)進(jìn)行分析是研究復(fù)雜表型分子機(jī)制的重要研究手段，且轉(zhuǎn)錄組學(xué)產(chǎn)生的富含大量生物學(xué)信息的基因表達(dá)數(shù)據(jù)為系統(tǒng)性的研究復(fù)雜表型的分子基礎(chǔ)提供了可能。因此本文圍繞“高原習(xí)服及習(xí)服不良過程中基因表達(dá)特征及其病理生理學(xué)意義”這一主題，從兩個部分詳細(xì)開展研究。
　　第一部分，對

2、漢族人群進(jìn)入高原前、進(jìn)入高原早期、中期、后期以及返回平原早期和后期進(jìn)行了連續(xù)動態(tài)的觀察。在此期間，采集個體生理數(shù)據(jù)及臨床癥狀表型，使用RNA-Seq技術(shù)檢測全血細(xì)胞基因表達(dá)情況，采用WGCNA算法尋找各時間階段特異表達(dá)基因，結(jié)合基因注釋數(shù)據(jù)庫以及文獻(xiàn)對其病理生理學(xué)意義進(jìn)行研究，深入了解高原習(xí)服的本質(zhì)。第二部分，比較AMS和HAPC患者與未患病者高原低氧暴露后基因表達(dá)變化，構(gòu)建并比較AMS和HAPC患者和未患病者差異表達(dá)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，從

3、網(wǎng)絡(luò)水平研究與AMS和HAPC發(fā)生相關(guān)的基因共表達(dá)模式及其關(guān)鍵基因，為高原病發(fā)病機(jī)制的研究提供重要的線索。
　　方法:
　　1.本研究分別進(jìn)行了2次獨(dú)立的人群實驗:①動態(tài)觀察16名健康男性漢族志愿者人群進(jìn)入高原前、進(jìn)入高原(5300m)早期(3d)、中期(4m)、后期(1y)以及返回平原早期(1m)和后期(6m)血壓、心率及血氧飽和度變化，同時采集靜脈血用于RNA-Seq測序、血紅蛋白濃度檢測以及血漿細(xì)胞因子檢測;②采集10

4、9名健康男性漢族志愿者進(jìn)入高原前的靜脈血，分離血漿用于microRNA表達(dá)譜測定，觀察記錄志愿者進(jìn)入高原(3658m)后AMS的發(fā)病情況及癥狀評分。
　　2.提取全血細(xì)胞總RNA，構(gòu)建PE測序文庫，采用Illumina HiSeq2000測序平臺進(jìn)行RNA-Seq測序。
　　3.采用BGI標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)處理流程評估RNA-Seq原始序列數(shù)據(jù)質(zhì)量并比對到人類參考基因組(hg19);采用FPKM值對基因表達(dá)值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和定量，R軟件包

5、edgeR分析組間差異表達(dá)基因，取|Fold change|≥2且FDR＜0.05為閾值;采用WGCNA算法對基因表達(dá)量進(jìn)行系統(tǒng)分析，根據(jù)基因表達(dá)相似性劃分基因模塊，獲取進(jìn)入高原早期、中期、后期以及返回平原早期及后期特異表達(dá)基因并根據(jù)基因間關(guān)聯(lián)度構(gòu)建各自共表達(dá)網(wǎng)絡(luò);使用clusterProfiler軟件包及在線分析工具REVIGO對各階段特異表達(dá)基因進(jìn)行生物學(xué)注釋;結(jié)合已報道文獻(xiàn)對網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵基因的生物學(xué)功能進(jìn)行詳細(xì)探討。
　　4.

6、使用RPKM標(biāo)準(zhǔn)化和定量AMS患者與未患病者轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量;采用densitybased pruning算法篩選AMS患者和未患病者急進(jìn)高原前后差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本;使用DAVID中Gene Functional Classification工具對差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行生物學(xué)注釋并歸類;根據(jù)聚類網(wǎng)絡(luò)理論計算AMS患者與未發(fā)病者進(jìn)入高原后基因的拓?fù)渲睾暇仃嘜T(i，j)，并構(gòu)建比較兩者基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。
　　5.使用ELISA法對AMS

7、患者和未患病者血漿中IL10、CCL8及IL17F含量進(jìn)行檢測;采用化學(xué)發(fā)光法對AMS患者和未患病者IL10含量進(jìn)行重復(fù)性驗證。
　　6.使用miRCURYTM LNA Array檢測健康男性漢族志愿者進(jìn)入高原前血漿中microRNA表達(dá)譜;使用qRT-PCR法對差異microRNA進(jìn)行驗證并使用R軟件包OptimalCutpoints對其在AMS發(fā)病風(fēng)險中的預(yù)測效能進(jìn)行評價。
　　7.使用microT-CDS和TarBas

8、e工具對microRNA的調(diào)控靶基因進(jìn)行分析;使用DIANA-miRPath對microRNA靶基因進(jìn)行生物學(xué)注釋。
　　結(jié)果:
　　1.進(jìn)入高原早期，參與多巴胺代謝、離子轉(zhuǎn)運(yùn)及血紅蛋白合成的基因特異性表達(dá)，基因MXI1、RNF10、TRIM58、GLRX5和BPGM處于共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的中心位置;中期，基因表達(dá)模式與進(jìn)入高原前相似;后期，參與磷代謝、免疫系統(tǒng)與MAPK信號通路調(diào)節(jié)、細(xì)胞內(nèi)吞及囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)的基因特異性表達(dá)，基因SMAR

9、CD2、CDK9及RIC8A處于共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的中心位置。
　　2.返回平原早期，參與大分子物質(zhì)、核酸代謝，細(xì)胞增殖分化的基因特異性表達(dá)，基因MTF2、ZFR、CAND1、DEPDC1、DEPDC1B、CCNA2、CDC6、CDC20、CCNB2、CCNB1和ANLN處于共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的中心位置;后期參與免疫炎癥反應(yīng)的基因特異性表達(dá)，基因ZBP1、STAT2、IFIT1、IFIT2和IFIT3處于共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的中心位置。
　　3.與A

10、MS未發(fā)病者相比，免疫和炎癥反應(yīng)在AMS患者差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本中顯著富集(富集分?jǐn)?shù):3.44，3.27);AMS患者與未患病者基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中IL10、CCL8和IL17F的度存在顯著差異;蛋白水平上，進(jìn)入高原后AMS患者IL10的表達(dá)顯著下調(diào)，CCL8和IL17F顯著增加，未發(fā)病者IL10顯著上調(diào)，IL17F顯著下調(diào)，CCL8改變無統(tǒng)計學(xué)差異;且在另一人群中，急進(jìn)高原后，AMS患者IL10蛋白顯著下調(diào)(p=0.001)，未患病者無顯著改變

11、，IL10的改變量與急進(jìn)高原個體臨床癥狀評分間存在較強(qiáng)的相關(guān)性，r(22)=-0.52，p=0.013。
　　4.進(jìn)入高原前，AMS患者血漿miR-369-3p、miR-449b-3p和miR-136-3p表達(dá)量顯著高于未患病者;采用Logistic回歸模型發(fā)現(xiàn)miR-369-3p、miR-449b-3p和miR-136-3p組合對AMS發(fā)病風(fēng)險預(yù)測的敏感度和特異度達(dá)到92.68％和93.48％，AUC:0.986，95％CI:0

12、.970-1.000，p＜0.001，LR+:14.21，LR-:0.08;生物信息學(xué)分析提示miR-369-3p，miR-449b-3p和miR-136-3p調(diào)控的靶基因主要參與含氮化合物的代謝過程及神經(jīng)營養(yǎng)因子TRK受體信號通路。
　　5.HAPC患者較未發(fā)病者具有311個特有的差異上調(diào)基因，顯著富集于細(xì)胞增殖以及免疫調(diào)控過程;進(jìn)入高原后，HAPC患者表達(dá)上調(diào)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)平均度為22.64，是未患病者的2倍(11.85);

13、HAPC患者差異上調(diào)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中，中心性(Betweenesscentrality)較高的基因為IFT20和MRPL22，分別為0.50和0.46，未患病者中，中心性較高的基因為ITGAV和TPRKB，分別為0.50和0.37。
　　結(jié)論:
　　1.進(jìn)入高原早期，機(jī)體以MXI1、RNF10、TRIM58、GLRX5及BPGM為核心表達(dá)基因，調(diào)控參與多巴胺代謝、離子轉(zhuǎn)運(yùn)及血紅蛋白合成基因，提示在高原習(xí)服早期，機(jī)體主要通過增

14、加氧氣攝入、運(yùn)輸以及氧合血紅蛋白氧釋放效率等適應(yīng)高原環(huán)境，以實現(xiàn)機(jī)體內(nèi)、外環(huán)境的基本平衡;隨著高原暴露時間的延長，機(jī)體調(diào)動更多內(nèi)在機(jī)制參與內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)，其中以SMARCD2、CDK9及RIC8A為核心表達(dá)基因。這些基因通過調(diào)控參與磷代謝、免疫系統(tǒng)與MAPK信號通路調(diào)節(jié)、細(xì)胞內(nèi)吞及囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)的基因，促進(jìn)紅細(xì)胞增殖增加氧的運(yùn)輸，促進(jìn)組織血管新生縮短氧的彌散距離以及增強(qiáng)組織細(xì)胞對氧的利用等多種機(jī)制習(xí)服高原環(huán)境。在此過程中，機(jī)體的免疫系統(tǒng)激活

15、，其意義可能在于防御低氧損傷，確保機(jī)體自身穩(wěn)定。
　　2.從高原返回平原早期，機(jī)體以MTF2、DEPDC1、DEPDC1B、CCNA2、CDC6、CDC20、CCNB2、CCNB1和ANLN為核心表達(dá)基因，通過調(diào)控細(xì)胞的增殖分化，建立內(nèi)環(huán)境平衡狀態(tài);后期以ZBP1、STAT2及IFIT家族為核心表達(dá)基因，參與并增強(qiáng)免疫炎癥反應(yīng)，清除內(nèi)源性損傷因子并修復(fù)損傷組織。
　　3.炎癥反應(yīng)增強(qiáng)是AMS發(fā)生的重要機(jī)制。高原低氧引起AMS

16、患者基因共表達(dá)模式改變，導(dǎo)致抗炎因子IL10分泌減少，促炎細(xì)胞因子CCL8和IL17F分泌增加，可能是促使炎癥反應(yīng)增強(qiáng)進(jìn)而發(fā)生AMS的重要機(jī)制。
　　4.漢族人進(jìn)入高原前的血漿microRNA水平與AMS的發(fā)病風(fēng)險密切相關(guān)，其中血漿miR-369-3p、miR-449b-3p和miR-136-3p分子組合對AMS的發(fā)病風(fēng)險具有很好的預(yù)測效能，提示其是一種新的預(yù)測AMS易感性的生物標(biāo)志物。
　　5.參與細(xì)胞增殖以及免疫反應(yīng)的基

17、因過度上調(diào)以及基因間特有的共表達(dá)關(guān)系與HAPC的發(fā)生密切相關(guān)，其中以IFT20和MRPL22的作用尤為關(guān)鍵，提示其可能是HAPC發(fā)病的重要環(huán)節(jié)和防治的重要靶點(diǎn)。
　　綜上所述，本論文采用RNA-Seq技術(shù)首次對漢族人群進(jìn)入高原前，進(jìn)入高原早期、中期和后期以及返回平原早期和后期全過程全血細(xì)胞基因表達(dá)進(jìn)行了動態(tài)觀察，從系統(tǒng)的角度對高原習(xí)服及脫習(xí)服過程中不同時間段特異表達(dá)基因及其病理生理學(xué)意義進(jìn)行了研究，為理解高原習(xí)服的本質(zhì)提供了重要的