手足口病的病原學(xué)鑒定和流行病學(xué)研究及重組多價(jià)腸道病毒疫苗研究.pdf

1、手足口病（hand, foot, mouth disease,HFMD）是一種由人類腸道病毒（human enterovirus,HEV）感染引起的疾病，好發(fā)于嬰幼兒，能夠引發(fā)廣泛的臨床癥狀，如發(fā)燒、口腔皰疹、四肢遠(yuǎn)端皮疹等。通常，手足口病癥狀輕微，10-14天可自行消退，少數(shù)情況下會導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，甚至造成死亡。我國衛(wèi)生部于2008年5月2日將其納入傳染病防治法規(guī)定的丙類傳染病進(jìn)行管理。近年來，手足口病一直是發(fā)病數(shù)和死亡數(shù)最

2、高的丙類傳染病病種。
　　引起HFMD的主要病原體為人類腸道病毒71型（human enterovirus71,EV71）和柯薩奇病毒A組16型（coxsackievirus A16,CoxA16），通常CoxA16引起的手足口病癥狀較輕，而EV71更易導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)感染威脅兒童生命。EV71屬于小RNA病毒科，VP1作為其主要的衣殼蛋白，在EV71對宿主細(xì)胞的吸附和穿入過程中起重要作用；同時(shí)，VP1上存在特異性中和性抗原表位，是E

3、V71最主要的抗原決定簇，在EV71疫苗的研究中十分重要。
　　本研究對河南省信陽地區(qū)2014年6月到2015年12月收集到的HFMD病例進(jìn)行病原學(xué)檢測及流行病學(xué)分析。我們收集了46份HFMD患兒的糞便樣本，提取病毒RNA，分別用EV71 VP1通用型引物和CoxA16 VP1通用型引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR）擴(kuò)增，并對

4、產(chǎn)物進(jìn)行測序，結(jié)果顯示46份樣本中EV71陽性16例，CoxA16陽性14例。對測序結(jié)果進(jìn)行序列分析比對，確定分離到的EV71均屬于C4a亞型，與歷年河南地區(qū)分離得到的毒株序列比較未見明顯差異；與吉林、廣東以及廣西地區(qū)分離的毒株相比較同樣沒有明顯差異，提示樣本中分離得到的EV71毒株無南北地域差別；同時(shí)與2008年安徽阜陽EV71流行株VP1序列比對亦未見明顯差異，提示為國內(nèi)循環(huán)流行株。通過Clustal X軟件對本研究中分離到的8株病

5、毒的VP1區(qū)與C基因型毒株VP1區(qū)進(jìn)行比對，結(jié)果顯示核苷酸同源性為85.5％～96.6%；與A-BrCr-USA-70原型株VP1區(qū)進(jìn)行比對，結(jié)果顯示核苷酸同源性為82.4%～83%；與B-MS嗜神經(jīng)毒株VP1區(qū)進(jìn)行比對，結(jié)果顯示核苷酸同源性為83.7%～85.1%，提示本次分離到的毒株與上述原型株和嗜神經(jīng)毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。
　　在流行病學(xué)調(diào)查方面，我們分析了上述46名患兒發(fā)病的時(shí)間、臨床癥狀、年齡、性別、居住地。結(jié)果顯示本次收集

6、到的病例2014年6月和7月及2015年11月和12月病例較多，均為輕癥臨床上難以分辨其病原；4歲以下患兒占到83%；男女比例為1.2:1；居住地在農(nóng)村與城市比例為4.1:1。提示在信陽地區(qū)手足口病發(fā)病季節(jié)可能有兩個(gè)高峰期，對手足口病病原的鑒定有賴于在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的分子生物學(xué)檢測，4歲以下幼兒尤其是男孩感染的可能性更高，農(nóng)村比城市具有更高的危險(xiǎn)性。
　　研制EV71和CoxA16的預(yù)防疫苗是防治手足口病暴發(fā)的主要手段之一。在重組多價(jià)

7、腸道病毒疫苗研究方面，我們將脊髓灰質(zhì)炎病毒（poliovirus）的減毒株Sabin1全長分四個(gè)片段進(jìn)行克隆并構(gòu)建到了pMD18-T載體上，繼而構(gòu)建了EV71 VP1和CoxA16 VP1的真核表達(dá)質(zhì)粒pcFlag-EV71-VP1和pcFlag-CA16-VP1并在轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中檢測到VP1融合蛋白的表達(dá)，為后續(xù)以Sabin1為載體構(gòu)建EV71和CoxA16疫苗的研究打下了良好的基礎(chǔ)。
　　本研究對于手足口病病原研究及分子流行病