銅綠假單胞菌PAO1中C-di-GMP代謝基因的研究.pdf

1、目的：對(duì)銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）PAO1中第二信使分子環(huán)鳥苷二磷酸(cyclic di-guanylate mono-phosphate，c-di-GMP)代謝相關(guān)的基因進(jìn)行研究及探討，以期加深對(duì)銅綠假單胞菌致慢性感染的相關(guān)分子機(jī)制的理解。
　　方法：從同行實(shí)驗(yàn)室獲得PAO1野生型菌株及多個(gè)C-di-GMP代謝相關(guān)的具有GGDEF、EAL及GGDEF-EAL結(jié)構(gòu)域基因的轉(zhuǎn)座子突變體菌株。首

2、先采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR），以來確認(rèn)各個(gè)突變菌株的轉(zhuǎn)座子插入情況。之后對(duì)轉(zhuǎn)座子突變菌株進(jìn)行生物膜（Biofilm）和泳動(dòng)性（Motility）表型分析，通過表型的變化，篩選出感興趣的基因。利用PCR技術(shù)將相關(guān)基因的催化結(jié)構(gòu)域進(jìn)行克隆以及構(gòu)建原核表達(dá)載體。成功構(gòu)建的表達(dá)載體經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，進(jìn)行重組蛋白的表達(dá)及分析。選擇溶解性良好的重組蛋白進(jìn)行生物學(xué)活性分析，使用高效液相色譜(High

3、 Performance Liquid Chromatography，HPLC)的方法，參照標(biāo)準(zhǔn)品以及文獻(xiàn)，以分析重組蛋白的催化活性。
　　結(jié)果：1.通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)驗(yàn)，使用轉(zhuǎn)座子特異引物及基因特異引物，得到明亮清晰的條帶，確認(rèn)轉(zhuǎn)座子插入預(yù)期的基因位點(diǎn)中，導(dǎo)致其失活成為突變菌株；而無明亮條帶出現(xiàn)的則為插入失活失敗，即為非轉(zhuǎn)座子插入菌株。
　　2.對(duì)野生型PAO1菌株和篩選出的四個(gè)GGDEF-EAL突變菌株進(jìn)行Biofil

4、m表型分析比較。在LB液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)12小時(shí)的各株細(xì)菌，經(jīng)結(jié)晶紫染色，生物膜定量分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，與野生型PAO1相比，PA0285、PA0575、PA5442基因插入失活，導(dǎo)致生物膜變化差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而PA5295變化不明顯，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　3.對(duì)野生型PAO1菌株和四個(gè)GGDEF-EAL突變菌株進(jìn)行Motility表型分析，測(cè)量同一平板上的野生型PAO1和轉(zhuǎn)座子突變體菌株的菌落

5、直徑。PA0285、PA0575、PA5442轉(zhuǎn)座子突變體菌落直徑與野生型PAO1間具有顯著差異（P＜0.05)，而PA5295轉(zhuǎn)座子突變體與PAO1間無顯著差異（P＞0.05)。
　　4.綜合分析多個(gè)轉(zhuǎn)座子突變菌株的表型分析，輔以大量相關(guān)研究文獻(xiàn)，對(duì)尚未研究報(bào)道而我們感興趣的多個(gè)GGDEF-EAL結(jié)構(gòu)域基因進(jìn)行克隆，轉(zhuǎn)化入E.coli DH5α中并驗(yàn)證是否構(gòu)建成功。測(cè)序驗(yàn)證后再將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入E.coli BL21，以IPTG誘導(dǎo)

6、產(chǎn)生蛋白，并用SDS-PAGE進(jìn)行檢測(cè)。
　　5.選取體外表達(dá)的可溶性蛋白PA0847，進(jìn)行體外生物學(xué)活性分析，使用高效液相色譜技術(shù)對(duì)蛋白的體外催化活性進(jìn)行檢測(cè)，得出其在體外有鳥甘酸環(huán)化酶（diguanylate cyclase，DGC）的活性，即PA0847的GGDEF結(jié)構(gòu)域在體外表現(xiàn)出了C-di-GMP合成酶的活性。
　　結(jié)論：研究者們已知具有GGDEF/EAL結(jié)構(gòu)域的基因涉及細(xì)菌中第二信使C-di-GMP的合成與分解，