銅綠假單胞菌脅迫條件下持久表達(dá)基因的研究.pdf

1、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginasa，PA)是一種革蘭氏陰性細(xì)菌，是醫(yī)院感染的三大致病菌之一，能夠引起致命性的急慢性感染。銅綠假單胞菌具有多重耐藥機(jī)制，并能在貧營(yíng)養(yǎng)、重污染等條件下抵抗脅迫生存，持久存活于肺纖維囊腫( Cystic Fibrosis，CF)病人體內(nèi)。在治療銅綠假單胞菌感染的過程中，有少量菌體在脅迫條件下存活于人體內(nèi)，在一定的條件下再次引起感染，使得慢性病人長(zhǎng)期反復(fù)感染，難以治愈。因此研究PA的持久生

2、存機(jī)制，在此基礎(chǔ)上開發(fā)可以有效阻斷與病原菌持久存活相關(guān)的路徑，對(duì)于有效控制臨床上銅綠假單胞菌的長(zhǎng)期感染，打破傳統(tǒng)抗生素易于產(chǎn)生耐藥性的局限性具有重要意義。 本研究對(duì)以luxCDABE為報(bào)道子的銅綠假單胞菌PAO1隨機(jī)啟動(dòng)子庫(約3456個(gè)克隆)進(jìn)行篩選，尋找能夠在脅迫條件下引起持久發(fā)光的啟動(dòng)子，通過測(cè)序、比對(duì)，確定這些啟動(dòng)子相應(yīng)的基因位置。挑選出其中具有長(zhǎng)期條件下表達(dá)典型的基因進(jìn)行敲除。對(duì)突變體與野生型菌株進(jìn)行比較：在脅迫條件

3、下長(zhǎng)期培養(yǎng)并通過菌落形成單位(CFU)測(cè)其各自的存活率；對(duì)野生型與突變株進(jìn)行共培養(yǎng)，讓其在競(jìng)爭(zhēng)狀態(tài)下長(zhǎng)期培養(yǎng)，然后分別測(cè)定其存活率；設(shè)計(jì)長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)的高滲透與低pH的脅迫條件來測(cè)定突變株在外加脅迫條件下的適應(yīng)性。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，從銅綠假單胞菌PAO1隨機(jī)啟動(dòng)子庫中篩選出157株在脅迫條件下長(zhǎng)期表達(dá)的菌株，其啟動(dòng)子對(duì)應(yīng)的基因被假定與PAO脅迫條件下生存相關(guān)。通過基因比對(duì)，最后確定了45個(gè)與持久生存相關(guān)的基因，其中14個(gè)是推測(cè)生物合

4、成代謝相關(guān)基因，5個(gè)是假定的編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子，4個(gè)是假定的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，另有4個(gè)已知基因和18個(gè)功能完全未知的基因。挑選其中7個(gè)( PA0423、PA1216、PA2827、PA0550、PA0256、PA0057、PA4578)重復(fù)性高且在在持久存活過程中表達(dá)明顯的基因作為實(shí)驗(yàn)的目的基因重點(diǎn)研究，利用基因敲除技術(shù)分別使目的基因功能缺失，得到7株突變株。通過對(duì)比實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：這七個(gè)基因均與菌體持久生長(zhǎng)相關(guān)，其中五個(gè)基因( PA1216，PA