銅綠假單胞菌外膜囊泡的研究.pdf

1、第一部分 PAO1外膜囊泡的提取的方法學(xué)建立及優(yōu)化
　　目的:建立并優(yōu)化銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）外膜囊泡(out membrane vesicle，OMV)體外的提取及純化方法，為研究OMV的生物學(xué)活性及誘導(dǎo)感染發(fā)生的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　方法:以銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)AO1為模式菌，分別采用分別采取超濾濃縮法和Optiripe密度梯度超速離心分離法提取PAO1的外膜囊泡，負(fù)染電鏡檢測(cè)形

2、態(tài)及純度;BCA法檢測(cè)兩種方法提取的OMV蛋白濃度并計(jì)算OMV產(chǎn)量。
　　結(jié)果:超濾濃縮法提取的OMV含有較多雜質(zhì)，產(chǎn)量為21.3ug/1010個(gè)細(xì)菌，密度梯度離心提取的OMV無(wú)明顯雜質(zhì)存在，產(chǎn)量為48.7ug/1010個(gè)細(xì)菌。
　　結(jié)論:超濾濃縮法和Optiripe密度梯度超速離心法均可用于提取PA的外膜囊泡，但Optiripe密度梯度離心法提取的OMV的產(chǎn)率和純度均高于超濾濃縮法提取OMV。
　　第二部分 PAO1

3、外膜囊泡的成分及生物學(xué)活性檢測(cè)
　　目的:初步檢測(cè)PAO1的OMV中所含蛋白，建立OMV體內(nèi)體外感染模型，檢測(cè)OMV的生物學(xué)活性
　　方法:用SDS-PAGE電泳初步鑒定OMV中所含蛋白條帶，建立OMV感染人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B，ELISA檢測(cè)炎性因子IL-6、IL-8的表達(dá)水平;通過(guò)滴鼻方式建立OMV感染Bab1c小鼠模型，提取小鼠肺組織，HE染色觀察其炎性變化;通過(guò)多粘菌素B抵抗實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)OMV對(duì)細(xì)菌的保護(hù)作用。

4、
　　結(jié)果:SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示PAO1的OMV中含有多種蛋白條帶，主要為10-100KDa大小的蛋白;PAO1的OMV能顯著誘導(dǎo)Base-2B細(xì)胞表達(dá)炎性因子IL-6、IL-8，刺激Ba1bc小鼠肺組織發(fā)生明顯的炎性變化，且能幫助PAO1抵抗多粘菌素B的殺害。
　　結(jié)論:PAO1分泌的外膜囊泡為一個(gè)含有多種蛋白的混合體，具有誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生炎性反應(yīng)以及保護(hù)感染細(xì)菌抵抗周?chē)焕h(huán)境等多種生物學(xué)活性。
　　第三部

5、分 lasB對(duì)PAO1外膜囊泡的影響
　　目的:探討lasB基因?qū)AO1的OMV的形態(tài)、分泌量、及防御功能的影響。
　　方法:PCR鑒定PAO1標(biāo)準(zhǔn)株和lasB缺陷的PAO1株，用Optiripe密度梯度超速離心法提取PAO1標(biāo)準(zhǔn)株和lasB缺陷株的外膜囊泡，負(fù)染電鏡觀察兩種外膜囊泡的形態(tài)、BCA法檢測(cè)OMV蛋白濃度，計(jì)算OMV產(chǎn)率，通過(guò)剛果紅實(shí)驗(yàn)比較兩種外膜囊泡彈性蛋白酶活性大小，建立OMV感染正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞模型

6、，通過(guò)計(jì)算細(xì)菌吞噬率檢測(cè)OMV保護(hù)細(xì)菌抵抗單個(gè)核細(xì)胞吞噬的能力。
　　結(jié)果:PAO1標(biāo)準(zhǔn)株和lasB缺陷株體外分泌的外膜囊泡形態(tài)一致，均為20-200nm的球形結(jié)構(gòu)。與lasB缺陷株相比，PAO1標(biāo)準(zhǔn)株的OMV產(chǎn)率更高，所具有的彈性蛋白酶活性更強(qiáng)，且?guī)椭?xì)菌抵抗人外周血單個(gè)核細(xì)胞吞噬的能力更強(qiáng)。
　　結(jié)論:lasB缺陷對(duì)PAO1體外分泌的外膜囊泡形態(tài)無(wú)影響，但lasB缺陷后，外膜囊泡的分泌量、所含彈性蛋白酶活性以及對(duì)細(xì)菌的保